加入(ru)酶(mei)標(biao)記(ji)檢測抗(kang)體的核心註意(yi)事項(xiang)

    使(shi)用(yong)酶(mei)標(biao)記(ji)檢測抗(kang)體（常見的是酶(mei)標(biao)二(er)抗(kang)）是ELISA、WesternBlot、免疫(yi)組(zu)化等實(shi)驗(yan)中(zhong)的關鍵(jian)步(bu)驟(zhou)。以(yi)下(xia)是需要(yao)重(zhong)點(dian)關(guan)註的方面，分為實(shi)驗(yan)前(qian)、實(shi)驗(yan)中(zhong)、實(shi)驗(yan)後三(san)個(ge)階段。

    壹、實(shi)驗(yan)前(qian)準(zhun)備：抗(kang)體選(xuan)擇(ze)與保(bao)存

    特(te)異性(xing)是關鍵(jian)

    宿主來(lai)源：確(que)保(bao)檢測抗(kang)體（二(er)抗(kang)）所針對(dui)的宿主物(wu)種(zhong)與(yu)壹(yi)抗(kang)的宿主物(wu)種(zhong)匹(pi)配。例(li)如，小鼠(shu)來(lai)源的壹抗(kang)應(ying)選(xuan)擇(ze)抗(kang)小鼠(shu)的酶(mei)標(biao)二(er)抗(kang)。

    免疫(yi)球(qiu)蛋(dan)白類型：確(que)認(ren)壹抗(kang)的亞型（如IgG,IgM），並(bing)選擇針對(dui)該(gai)亞型的二(er)抗(kang)，以獲得信號。

    交(jiao)叉吸(xi)附：在進行(xing)多重(zhong)檢測或樣(yang)本(ben)含(han)有(you)多種物(wu)種(zhong)蛋白時，應(ying)選(xuan)擇(ze)經(jing)過(guo)交(jiao)叉吸(xi)附的二(er)抗(kang)，以減少(shao)非特(te)異性(xing)結合。

    酶(mei)與(yu)底物(wu)系(xi)統(tong)的選擇(ze)

    HRP（辣(la)根(gen)過(guo)氧(yang)化物(wu)酶(mei)）：

    優點(dian)：成本(ben)低、靈敏度(du)高(gao)、底(di)物多樣（如TMB,DAB）。

    註(zhu)意事項(xiang)：嚴禁(jin)使(shi)用(yong)含(han)疊氮(dan)鈉（NaN₃）的緩沖(chong)液，因(yin)為NaN₃是HRP的抑制(zhi)劑(ji)。同(tong)時(shi)，要避免溶(rong)液被微(wei)生物汙染。某(mou)些還(hai)原(yuan)劑（如DTT）也(ye)會使其(qi)失(shi)活(huo)。

    AP（堿(jian)性(xing)磷酸酶(mei)）：

    優點(dian)：穩(wen)定(ding)性(xing)好，不(bu)受NaN₃影(ying)響(xiang)。

    註(zhu)意事項(xiang)：應(ying)避(bi)免使(shi)用(yong)含(han)有(you)磷酸根(gen)離(li)子(zi)的緩沖(chong)液（如PBS），因(yin)為磷酸(suan)根(gen)是AP的競爭(zheng)性(xing)抑制(zhi)劑(ji)。推薦(jian)使(shi)用Tris緩(huan)沖液。

    抗(kang)體的保存與稀釋

    正(zheng)確(que)保(bao)存：嚴格(ge)按(an)照(zhao)說明(ming)書(shu)要(yao)求(qiu)保(bao)存，通(tong)常是-20℃分裝(zhuang)凍存，避免反復(fu)凍(dong)融。

    使(shi)用(yong)前(qian)離(li)心：短暫(zan)離心小管，將(jiang)液體收(shou)集至(zhi)管(guan)底(di)，避免損(sun)失(shi)和起泡(pao)。

    優化稀釋比例(li)：必(bi)須進行(xing)預(yu)實(shi)驗(yan)來(lai)優化二(er)抗(kang)的稀釋比例(li)。說明(ming)書(shu)提供的範圍(wei)是壹個(ge)參考(kao)起點(dian)。濃度過(guo)高(gao)會導致背景(jing)深(shen)，濃度過(guo)低則信號弱(ruo)。

    二(er)、實(shi)驗(yan)過(guo)程中(zhong)：孵(fu)育與(yu)洗滌

    封閉(bi)要(yao)充分

    在加入(ru)檢測抗(kang)體前(qian)，必(bi)須用惰性(xing)蛋白（如BSA、脫(tuo)脂奶粉(fen)、血(xue)清(qing)等）對(dui)膜(mo)或板(ban)進行(xing)充分封(feng)閉(bi)，以(yi)封(feng)堵(du)非特(te)異性(xing)結合位(wei)點(dian)，這(zhe)是降低背景(jing)的關鍵(jian)。

    孵(fu)育條(tiao)件(jian)優化

    溫度與(yu)時間(jian)：室(shi)溫孵(fu)育1小時或4℃過(guo)夜(ye)。4℃過(guo)夜(ye)通(tong)常結合更牢(lao)固(gu)，背景(jing)更低，但(dan)需要(yao)更長(chang)時(shi)間。室(shi)溫孵(fu)育更快(kuai)捷，但(dan)需註(zhu)意控制時間(jian)和溫度，避(bi)免背(bei)景(jing)過(guo)高(gao)。

    避(bi)光(guang)：如果(guo)酶(mei)標(biao)抗(kang)體偶(ou)聯了(le)熒光(guang)染料，整(zheng)個孵(fu)育過(guo)程需避(bi)光(guang)。

    均勻孵(fu)育：確(que)保(bao)抗(kang)體溶(rong)液能均勻覆蓋(gai)整個(ge)樣本，放在搖(yao)床(chuang)緩(huan)慢(man)搖(yao)動(dong)孵(fu)育效(xiao)果(guo)更佳。

    洗滌至關重(zhong)要

    洗滌：孵(fu)育後，必(bi)須使用洗滌緩沖液（如TBST、PBST）進行(xing)充分且嚴格(ge)的洗滌，以去(qu)除(chu)未結合的遊離(li)抗(kang)體。這(zhe)是降低背景(jing)有(you)效的壹步(bu)。

    洗滌次(ci)數與(yu)體積(ji)：通(tong)常建(jian)議(yi)洗滌3-5次(ci)，每(mei)次(ci)浸(jin)泡(pao)並(bing)搖(yao)動(dong)3-5分鐘(zhong)。使用足(zu)量的洗滌液。

    三(san)、實(shi)驗(yan)後：顯(xian)色與結果分析

    底物使用(yong)與(yu)顯(xian)色

    新(xin)鮮(xian)配制：尤其(qi)是HRP的底物(wu)，建(jian)議(yi)在使用(yong)前(qian)新(xin)鮮(xian)配制，以保(bao)證其(qi)活性(xing)。

    避光(guang)反應(ying)：某(mou)些底(di)物(wu)（如ECL）對(dui)光(guang)敏感，顯色(se)反應(ying)需(xu)在暗(an)室(shi)進行(xing)。

    控制反應(ying)時(shi)間(jian)：顯(xian)色反應(ying)時(shi)間(jian)不(bu)宜過(guo)長(chang)，否(fou)則會導致背景(jing)過(guo)高(gao)。壹(yi)旦達(da)到(dao)理(li)想的信號強(qiang)度，應(ying)及(ji)時終止(zhi)反應(ying)（對(dui)於ELISA）或進行(xing)成像(xiang)（對(dui)於WB）。

    設(she)立對(dui)照(zhao)

    陰(yin)性(xing)對(dui)照(zhao)：不(bu)加壹(yi)抗(kang)（只(zhi)加封(feng)閉(bi)液和二(er)抗(kang)），用於評(ping)估二(er)抗(kang)的非特(te)異性(xing)結合背(bei)景(jing)。

    空(kong)白對(dui)照(zhao)：不(bu)加壹(yi)抗(kang)和二(er)抗(kang)，用於評(ping)估底物自身的顯色(se)情(qing)況。

    陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)：使(shi)用(yong)已知(zhi)陽(yang)性(xing)的樣本(ben)，確(que)保(bao)整個實(shi)驗(yan)系(xi)統(tong)工作(zuo)正(zheng)常。

    總結

    成功(gong)使用(yong)酶(mei)標(biao)記(ji)檢測抗(kang)體是壹個(ge)系統(tong)性(xing)的優化過(guo)程，核心在於：

    選(xuan)對(dui)（特(te)異性(xing)）

    用好（稀釋度(du)、孵(fu)育條(tiao)件(jian)）

    洗凈（降低背景(jing)）

    控好（底物(wu)反應(ying)與(yu)對(dui)照(zhao)）

    遵(zun)循以(yi)上(shang)註意(yi)事(shi)項(xiang)，將(jiang)能(neng)顯著提高(gao)實(shi)驗(yan)的可靠(kao)性(xing)、靈敏度(du)和重(zhong)復性(xing)。

    註：以上(shang)僅供(gong)參(can)考(kao)，不(bu)作為實(shi)際(ji)數(shu)據，實(shi)驗(yan)需(xu)嚴格(ge)遵(zun)循說明(ming)或咨(zi)詢技術老師(shi)。

    ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)實(shi)驗(yan)本(ben)生壹直(zhi)視(shi)質(zhi)量控制為企業(ye)的生命，追求(qiu)企(qi)業(ye)競爭力(li)的不(bu)斷提升。公司(si)在經(jing)營(ying)中(zhong)始(shi)終秉承：遵(zun)紀守法(fa)，嚴於(yu)律(lv)己，寬仁(ren)以(yi)待，敢(gan)於(yu)承擔的企業(ye)精(jing)神(shen)作(zuo)為標準(zhun)，以(yi)過(guo)硬(ying)的質量和優良(liang)的服務(wu)來(lai)維(wei)護(hu)和拓(tuo)展(zhan)市場(chang)，較(jiao)大限度的滿足(zu)客戶的需求(qiu)。與(yu)客(ke)戶的共贏(ying)，是我(wo)們的發展(zhan)目(mu)標(biao)。本(ben)生!您信任的合作(zuo)夥(huo)伴(ban)。我(wo)們願(yuan)與(yu)您(nin)真(zhen)誠合作，共創美好的未來(lai)。