酶(mei)聯免疫吸附(fu)測定(ding)實驗(ELISA)的(de)操作(zuo)流(liu)程

　　Elisa 操作(zuo)流(liu)程(以人(ren)IL-4 ELISA KIT為例)：

　　檢(jian)測(ce)原理(li):

　　本(ben)實(shi)驗采(cai)用(yong)雙(shuang)抗體(ti)夾心(xin)ELISA法(fa)。抗人(ren)IL-4單(dan)抗(kang)包(bao)被(bei)於(yu)酶(mei)標(biao)板上(shang)，標(biao)本(ben)和(he)標(biao)準(zhun)品(pin)中(zhong)的(de)IL-4會 與(yu)單(dan)抗(kang)結(jie)合(he)，遊(you)離(li)的(de)成分被(bei)洗(xi)去(qu)。加(jia)入(ru)生(sheng)物素(su)化(hua)的(de)抗人IL-4抗(kang)體(ti)和辣根(gen)過(guo)氧(yang)化物酶(mei)標(biao)記(ji)的(de)親 和素(su)。生(sheng)物素(su)與(yu)親和(he)素(su)特異性(xing)結(jie)合(he);抗人IL-4抗(kang)體(ti)與(yu)結合(he)在(zai)單(dan)抗(kang)上(shang)的(de)人IL-4結合(he)而形成免疫 復合物，遊(you)離(li)的(de)成分被(bei)洗(xi)去(qu)。加(jia)入(ru)顯(xian)色底(di)物(wu)，若反應(ying)孔(kong)中(zhong)有IL-4，辣(la)根(gen)過(guo)氧(yang)化物酶(mei)會使無色 的(de)顯色劑現藍色，加(jia)終(zhong)止液(ye)變(bian)黃。在(zai)450nm處測OD值，IL-4濃度與(yu)OD450值之(zhi)間(jian)呈(cheng)正比，可(ke) 通過(guo)繪(hui)制標準(zhun)曲(qu)線求(qiu)出標(biao)本(ben)中(zhong)IL-4的(de)濃度。

　　試劑盒(he)組成(cheng)：

　　1.抗體(ti)預包(bao)被(bei)酶(mei)標(biao)板(8×12 或 8×6)

　　2.凍幹標準(zhun)品(pin)(2 / 1 支;0.5ng/支)

　　3.標準(zhun)品(pin)和標本(ben)稀(xi)釋液(ye)(橙蓋瓶)(1 瓶;20ml/12ml)

　　4.濃(nong)縮生(sheng)物素(su)化(hua)抗體(ti)(紫(zi)蓋瓶)(1 支)

　　5.生(sheng)物素(su)化(hua)抗體(ti)稀(xi)釋液(ye)(藍(lan)蓋瓶)(1 瓶;16ml/10ml)

　　6.濃(nong)縮酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)(棕蓋瓶)(1 支)

　　7.酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)稀(xi)釋液(ye)(紫(zi)蓋瓶)(1 瓶;16ml/10ml)

　　8.濃(nong)縮洗(xi)滌(di)液(ye) 20× (白蓋瓶)(1 瓶;50ml/25ml)

　　9.顯(xian)色底(di)物(wu)(TMB)(棕蓋瓶)(1 瓶;12ml/6ml)

　　10.反應(ying)終(zhong)止(zhi)液(ye)(紅(hong)蓋瓶)(1 瓶;12ml/6ml)

　　11.封板膠紙(zhi)(6/3 張)

　　12.產(chan)品說(shuo)明書(shu)(1 份)

　　酶(mei)聯免疫試(shi)劑盒(he)標本(ben)收集:

　　1. 收集血液(ye)的(de)試管應(ying)為壹次(ci)性的(de)無熱原，無(wu)內毒素(su)試(shi)管。

　　2. 血漿抗(kang)凝(ning)劑推(tui)薦使用EDTA。避(bi)免使用溶血，高血脂(zhi)標本(ben)。

　　3. 標(biao)本(ben)應(ying)清澈透(tou)明，懸(xuan)浮物(wu)應(ying)離(li)心(xin)去除。

　　4. 標(biao)本(ben)收集後(hou)若(ruo)不(bu)及(ji)時(shi)檢測(ce)，請(qing)按(an)壹次(ci)使用量分(fen)裝(zhuang)，凍存於(yu)-20℃，-70℃電冰箱(xiang)內，避(bi)免反復凍融，3-6月內(nei)檢(jian)測。

　　5. 如(ru)果您的(de)樣本(ben)中(zhong)檢測(ce)物(wu)濃(nong)度高於(yu)標準(zhun)品(pin)最高值，請(qing)根(gen)據實際(ji)情況，做適當倍(bei)數稀(xi)釋(建(jian) 議(yi)做預(yu)實驗，以確定稀(xi)釋倍(bei)數)。

　　酶(mei)聯免疫試(shi)劑盒(he) 註意事(shi)項(xiang):

　　1. 試劑盒(he)使用前請(qing)保(bao)存在(zai)2-8℃。復溶後(hou)的(de)標準(zhun)品(pin)應(ying)分(fen)裝(zhuang)後(hou)，將其(qi)放(fang)在(zai)-20～-70℃貯存。

　　2. 濃(nong)縮(suo)生(sheng)物素(su)化(hua)抗體(ti)，濃縮酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)體(ti)積(ji)小(xiao)，運輸(shu)中(zhong)顛(dian)簸(bo)和(he)可(ke)能的(de)倒置，會使液(ye)體(ti)沾到管壁(bi) 或瓶蓋。因此(ci)使用前請(qing)用(yong)手(shou)甩(shuai)幾(ji)下或1000轉(zhuan)/分(fen)離心(xin)1分鐘(zhong)，以使附(fu)著(zhe)管壁(bi)或瓶蓋的(de)液(ye)體(ti)沈積(ji)到(dao)管(guan)底(di)。取(qu)用前(qian)，請(qing)用(yong)移(yi)液(ye)器小(xiao)心(xin)吹打4-5次(ci)使溶液(ye)混(hun)勻。

　　3. 從(cong)冰箱(xiang)中(zhong)取(qu)出的(de)濃縮洗(xi)滌(di)液(ye)可(ke)能有(you)結晶(jing),屬於(yu)正常現象，微(wei)加(jia)熱至(zhi)40℃使結晶(jing)溶解(jie)後(hou) 再配(pei)制洗(xi)滌(di)液(ye)。(加(jia)熱溫(wen)度不(bu)要(yao)超(chao)過(guo)50℃)使用時(shi)洗(xi)滌(di)液(ye)應(ying)為室(shi)溫(wen)。

　　4. 若需要(yao)分(fen)次使用標準(zhun)品(pin)應(ying)按(an)照(zhao)每(mei)壹次(ci)用量分(fen)裝(zhuang)，將其(qi)放(fang)在(zai)-20～-70℃貯存。避(bi)免反復凍 融。

　　5. 不(bu)同批(pi)號的(de)試劑盒(he)組份(fen)不(bu)能混(hun)用(yong)(洗(xi)滌(di)液(ye)和(he)反應(ying)終(zhong)止(zhi)液(ye)除(chu)外)。

　　6. 充(chong)分輕(qing)微(wei)混(hun)勻對(dui)反應(ying)結(jie)果尤為重要(yao)，最(zui)好使用微(wei)量振(zhen)蕩器(使用頻率)，如無(wu)微(wei)量振(zhen)蕩器，可(ke)在(zai)反應(ying)前(qian)手(shou)工(gong)輕輕敲擊(ji)酶(mei)標(biao)板框混(hun)勻。

　　7. 在(zai)試驗中(zhong)標準(zhun)品(pin)和樣本(ben)檢(jian)測(ce)時(shi)建(jian)議(yi)作(zuo)雙(shuang)孔(kong)檢(jian)測(ce)。

　　8. 試(shi)驗中(zhong)所用(yong)的(de)試管和(he)吸頭(tou)均為壹次(ci)性使用，嚴(yan)禁在(zai)不(bu)同的(de)液(ye)體(ti)之間混(hun)用(yong)!否則將影(ying)響試 驗結(jie)果。

　　9. 試驗中(zhong)請(qing)穿(chuan)著(zhe)試驗服並帶乳(ru)膠手(shou)套做(zuo)好防(fang)護工(gong)作(zuo)。特別(bie)是(shi)檢(jian)測(ce)血液(ye)或者其(qi)他體(ti)液(ye)標(biao)本(ben)時(shi)， 請(qing)按(an)國家(jia)生(sheng)物試(shi)驗室(shi)安(an)全(quan)防(fang)護條列執行(xing)。

　　檢測(ce)前(qian)準(zhun)備工作(zuo):

　　1. 請(qing)提(ti)前(qian)20分(fen)鐘(zhong)從(cong)冰箱(xiang)中(zhong)取(qu)出試(shi)劑盒(he)，以平(ping)衡(heng)至(zhi)室(shi)溫(wen)。

　　2. 將濃縮洗(xi)滌(di)液(ye)用(yong)雙(shuang)蒸(zheng)水稀(xi)釋(1:20)。未用完(wan)的(de)放(fang)回(hui)4℃。

　　3. 標準(zhun)品(pin): 加入(ru)標(biao)準(zhun)品(pin)/標本(ben)稀(xi)釋液(ye)0.5ml至(zhi)凍幹標準(zhun)品(pin)中(zhong)，靜置15分(fen)鐘(zhong)，待其(qi)充(chong)分溶(rong)解(jie)後(hou)，輕(qing)輕混(hun)勻(濃(nong)度為1000 pg/ml)。然(ran)後(hou)根(gen)據需要(yao)進(jin)行稀(xi)釋。(建(jian)議(yi)標準(zhun)曲(qu)線使用以下濃度： 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、0 pg/ml)。復溶標準(zhun)品(pin)原液(ye)(1000 pg/ml)若(ruo)未用完(wan)請(qing)分(fen)裝(zhuang)後(hou)放(fang)入(ru)-20℃以下電冰箱(xiang)內保(bao)存，保(bao)存兩(liang)個月。已稀(xi)釋的(de)標準(zhun)品(pin)請(qing)廢(fei)棄。

　　4. 生(sheng)物素(su)化(hua)抗體(ti)工作(zuo)液(ye)：按(an)當(dang)次試驗所(suo)需(xu)要(yao)得用(yong)量，使用前20分(fen)鐘(zhong)，以生(sheng)物素(su)化(hua)抗體(ti)稀(xi)釋液(ye)稀(xi)釋濃縮(suo)生(sheng)物素(su)化(hua)抗體(ti)(1:30)成工作(zuo)濃(nong)度。當日使用。若實(shi)驗次(ci)數過(guo)多(duo)導(dao)致(zhi)生(sheng)物素(su)化(hua) 抗體(ti)量不(bu)足，可(ke)向我們(men)公(gong)司(si)單(dan)獨(du)購(gou)買生(sheng)物素(su)化(hua)抗體(ti)。(須提供抗體(ti)批(pi)號)

　　5. 酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)工作(zuo)液(ye)：按(an)當(dang)次試驗所(suo)需(xu)要(yao)得用(yong)量，使用前20分(fen)鐘(zhong)，以酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)稀(xi)釋液(ye)稀(xi)釋濃 縮(suo)酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)(1:30) 成工作(zuo)濃(nong)度。當日使用。若實(shi)驗次(ci)數過(guo)多(duo)導(dao)致(zhi)濃(nong)縮酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)量不(bu)足， 可(ke)向我們(men)公(gong)司(si)單(dan)獨(du)購(gou)買濃(nong)縮酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)。(須提供酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)批(pi)號)

　　酶(mei)聯免疫試(shi)劑盒(he)洗(xi)滌(di)方(fang)法(fa):

　　1. 自動(dong)洗(xi)板機(ji)：要(yao)求(qiu)註入(ru)的(de)洗(xi)滌(di)液(ye)為350ul，註入(ru)與(yu)吸出間(jian)隔(ge)15-30秒。洗(xi)板5次。

　　2. 手(shou)工(gong)洗(xi)板：甩盡孔(kong)內(nei)液(ye)體(ti)，在(zai)潔凈(jing)的(de)吸水紙(zhi)上(shang)拍(pai)幹，每孔(kong)加(jia)洗(xi)滌(di)液(ye)350ul，靜(jing)置30秒後(hou)甩(shuai)盡液(ye)體(ti)，在(zai)厚叠吸水紙(zhi)上(shang)拍(pai)幹。洗(xi)板5次。

　　操(cao)作(zuo)步(bu)驟:

　　1.從(cong)已平(ping)衡(heng)至(zhi)室(shi)溫(wen)的(de)密封袋(dai)中(zhong)取(qu)出試(shi)驗所(suo)需(xu)板條，未用的(de)板條和幹燥劑請(qing)放(fang)回(hui)鋁(lv)箔(bo)袋內(nei)壓 實自封條，密封口(kou)袋，放(fang)回(hui)4℃。

　　2.空白孔(kong)加(jia)標(biao)準(zhun)品(pin)和標本(ben)稀(xi)釋液(ye)，其(qi)余(yu)相(xiang)應(ying)孔(kong)中(zhong)加標(biao)本(ben)或不(bu)同濃度標準(zhun)品(pin)(100ul/孔(kong))，用(yong)封板膠紙(zhi)封住(zhu)反應(ying)孔(kong)，36℃孵箱(xiang)孵育(yu)90分(fen)鐘(zhong)。

　　3.提(ti)前20分鐘(zhong)準(zhun)備生(sheng)物素(su)化(hua)抗體(ti)工作(zuo)液(ye)。

　　4.洗(xi)板5次。

　　5.空(kong)白孔(kong)加(jia)生(sheng)物素(su)化(hua)抗體(ti)稀(xi)釋液(ye)，其(qi)余(yu)孔(kong)加(jia)入(ru)生(sheng)物素(su)化(hua)抗體(ti)工作(zuo)液(ye)(100ul/孔(kong))。用(yong)新(xin)封板膠紙(zhi)封住(zhu)反應(ying)孔(kong)，36℃孵箱(xiang)孵育(yu)60分(fen)鐘(zhong)。

　　6.提(ti)前20分鐘(zhong)準(zhun)備酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)工作(zuo)液(ye)。避(bi)光(guang)室(shi)溫(wen)(22-25 ) ℃ 放(fang)置。

　　7.洗(xi)板5次。

　　8.空(kong)白孔(kong)加(jia)酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)稀(xi)釋液(ye)，其(qi)余(yu)孔(kong)加(jia)入(ru)酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)工作(zuo)液(ye)(100ul/孔(kong))。用(yong)新(xin)封板膠紙(zhi)封住(zhu)反應(ying)孔(kong)，36℃孵箱(xiang)，避(bi)光(guang)孵育(yu)30分(fen)鐘(zhong)。

　　9.打(da)開酶(mei)標(biao)儀(yi)電(dian)源，預熱(re)儀(yi)器，設置好(hao)檢(jian)測程序。

　　10.洗(xi)板5次。

　　11.加(jia)入(ru)顯(xian)色底(di)物(wu)(TMB)100ul/孔(kong)，避(bi)光(guang)36℃孵箱(xiang)，避(bi)光(guang)孵育(yu)15分(fen)鐘(zhong)。

　　12.加(jia)入(ru)終(zhong)止液(ye)100ul/孔(kong), 混(hun)勻後(hou)即刻(ke)測(ce)量OD450值(zhi)(3分(fen)鐘(zhong)內(nei))。在(zai)儀器保(bao)存讀(du)數結果並打印(yin)壹份(fen)紙(zhi)質(zhi)結(jie)果。

　　13.實驗完(wan)畢(bi)後(hou)將未用完(wan)的(de)試劑按(an)規(gui)定的(de)保(bao)存溫(wen)度放(fang)回(hui)電冰箱(xiang)保(bao)存至(zhi)有效(xiao)期結束。

　　建(jian)議(yi)保(bao)存酶(mei)標(biao)板框，以備下次或者今(jin)後(hou)試(shi)驗使用。

　　結果判斷(duan):

　　1. 每(mei)個標準(zhun)品(pin)和標本(ben)的(de)OD值應(ying)減(jian)去空(kong)白孔(kong)的(de)OD值。

　　2. 手工(gong)繪(hui)制標準(zhun)曲(qu)線。以標(biao)準(zhun)品(pin)濃度作(zuo)橫(heng)坐標，OD值(zhi)作(zuo)縱坐標(biao)，以平(ping)滑線(xian)連接各(ge)標準(zhun)品(pin)的(de)坐標點。通過(guo)標(biao)本(ben)的(de)OD值可(ke)在(zai)標準(zhun)曲(qu)線上(shang)查(zha)出其(qi)濃(nong)度。

　　3. 若標(biao)本(ben)OD值(zhi)高(gao)於(yu)標準(zhun)曲(qu)線上(shang)限，應(ying)適(shi)當(dang)稀(xi)釋後(hou)重(zhong)測，計算(suan)濃(nong)度時(shi)應(ying)乘以稀(xi)釋倍(bei)數。

　　靈(ling)敏(min)度、特異性(xing)和(he)重(zhong)復性:

　　● 靈(ling)敏(min)度：最小(xiao)可(ke)測人IL-4達7pg/ml。

　　● 特異性(xing)：不(bu)與(yu)IL-1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及(ji)sTNF-RII等(deng)反應(ying)。

　　● 重(zhong)復性：板內，板間變(bian)異系(xi)數均<10%。

　　Elisa試(shi)劑盒(he) 本(ben)生(sheng)壹直視質(zhi)量控制為企業(ye)的(de)生(sheng)命(ming)，追(zhui)求(qiu)企業(ye)競爭力(li)的(de)不(bu)斷(duan)提(ti)升。公(gong)司(si)在(zai)經(jing)營中(zhong)始終(zhong)秉(bing)承(cheng)：遵紀守法(fa)，嚴(yan)於(yu)律己(ji)，寬仁(ren)以待，敢於(yu)承擔(dan)的(de)企業(ye)精(jing)神作(zuo)為標準(zhun)，以過(guo)硬的(de)質(zhi)量和(he)優良的(de)服務來(lai)維護和(he)拓(tuo)展(zhan)市場(chang)，較大限度的(de)滿(man)足客(ke)戶(hu)的(de)需求(qiu)。與(yu)客戶(hu)的(de)共贏，是(shi)我們(men)的(de)發展(zhan)目(mu)標(biao)。本(ben)生(sheng)!您信(xin)任(ren)的(de)合作(zuo)夥(huo)伴(ban)。我們(men)願(yuan)與(yu)您真誠合作(zuo)，共(gong)創美(mei)好的(de)未來。