本生闡述：小(xiao)鼠轉(zhuan)化(hua)生(sheng)長因(yin)子β1 ELISA試劑(ji)盒(he)技(ji)術(shu)資料

　　適(shi)用於(yu)小鼠(shu)血(xue)清(qing)、血(xue)漿或細(xi)胞(bao)培(pei)養上(shang)清(qing)液等(deng)樣(yang)本

　　介紹(shao)：

　　轉化(hua)生(sheng)長因(yin)子β(TGF-β)是(shi)調(tiao)節細胞(bao)生(sheng)長和分(fen)化(hua)的(de) TGF-β超家族(zu)。這(zhe)壹(yi)家族(zu)除 TGF-β1 至(zhi)TGF-β5 外(wai)，還(hai)有活(huo)化素(su)、抑(yi)制素(su)、繆(mou)勒(le)氏(shi)管(guan)抑(yi)制物(wu)質(zhi)(MIS)和骨(gu)形成蛋白(BMPs)(1)。TGF-β是(shi)根(gen)據這(zhe)種細(xi)胞(bao)因(yin)子能使正(zheng)常的成(cheng)纖維細胞(bao)的(de)表(biao)型發生轉化(hua)命(ming)名的(de)。TGF-β1 的生物學功(gong)能主(zhu)要在炎癥(zheng)、組織(zhi)修(xiu)復和胚(pei)胎發育等(deng)方(fang)面(mian)，TGF-β對(dui)細胞(bao)的(de)生(sheng)長、分(fen)化和免(mian)疫功(gong)能都有重(zhong)要的調(tiao)節作(zuo)用(yong)。

　　檢測(ce)原(yuan)理：

　　ELISA 試劑(ji)盒(he)采(cai)用基(ji)於(yu)雙抗(kang)體夾心(xin)法(fa)的(de)酶聯免疫吸附(fu)檢測(ce)技(ji)術(shu)。將(jiang)

　　抗(kang)小(xiao)鼠(shu) TGF-β1 單克隆(long)抗(kang)體包被(bei)在酶標(biao)板(ban)上;分(fen)別加(jia)入(ru)梯度(du)稀釋的(de)標(biao)準品(pin)和預(yu)稀釋的(de)樣(yang)本，標(biao)準品(pin)和樣(yang)本中的(de)小鼠(shu) TGF-β1 會(hui)與(yu)酶標(biao)板(ban)上的(de)包被(bei)抗體充分(fen)結合;洗板(ban)後加(jia)入(ru)生物素(su)化(hua)抗(kang)小鼠(shu) TGF-β1 抗體，該抗(kang)體會(hui)與(yu)板(ban)子上包(bao)被(bei)抗體捕獲的標(biao)準品(pin)和樣(yang)本中的(de)小鼠(shu) TGF-β1發(fa)生(sheng)特(te)異性(xing)結(jie)合;洗板(ban)後加(jia)入(ru)辣(la)根過(guo)氧(yang)化物(wu)酶(HRP)標(biao)記(ji)的(de)鏈(lian)黴(mei)親(qin)和素(su)，生(sheng)物(wu)素與(yu)鏈(lian)黴(mei)親(qin)和素(su)會(hui)發(fa)生高(gao)強(qiang)度(du)的非共(gong)價(jia)結合;洗板(ban)後加(jia)入(ru)顯色劑(ji)底物 TMB，若(ruo)反(fan)應孔中(zhong)樣(yang)品(pin)存(cun)在不同濃度(du)的小(xiao)鼠 TGF-β1，則 HRP 會(hui)使(shi)無(wu)色 TMB 變成不同深(shen)淺(正(zheng)相關)的(de)藍色物(wu)質(zhi)，加(jia)入(ru)終止液後(hou)反(fan)應孔會(hui)變成黃(huang)色;最(zui)後，在(zai)λmax=450 nm(OD=450 nm)處(chu)測(ce)定反應孔樣(yang)品(pin)吸光度(du)(OD)，樣本中的(de)小鼠(shu) TGF-β1 濃度(du)與(yu) OD 成(cheng)正(zheng)比，通過(guo)繪(hui)制(zhi)標(biao)準曲線和四參數(shu)擬(ni)合軟件(jian)便可計(ji)算(suan)出樣(yang)本中小(xiao)鼠 TGF-β1 的(de)濃度(du)。

　　註意(yi)事(shi)項：

　　1. 試(shi)劑(ji)盒(he)應在(zai)有效(xiao)期(qi)內使(shi)用(yong)，請不要使用過(guo)期(qi)的試(shi)劑(ji)。

　　2. 試劑(ji)盒(he)未使用時應保存(cun)在 2-8℃冰(bing)箱(xiang)，已(yi)復溶但(dan)未用完(wan)的標(biao)準品(pin)，請丟(diu)棄。

　　3. 試(shi)劑(ji)盒(he)使(shi)用前(qian)請在室溫(wen)恢(hui)復 30 min，且(qie)充分(fen)混勻(yun)試(shi)劑(ji)盒(he)裏(li)的各種成(cheng)份及(ji)制(zhi)備的(de)樣(yang)品(pin)。

　　4. 在試驗(yan)中標(biao)準品(pin)和樣(yang)本建(jian)議作(zuo)復孔檢(jian)測(ce)，且(qie)加入(ru)試劑(ji)的順(shun)序(xu)應保持壹(yi)致(zhi)。

　　5. 為避免(mian)交(jiao)叉(cha)汙(wu)染，請在試(shi)驗(yan)中使用(yong) 1 次(ci)性(xing)試(shi)管(guan)，槍(qiang)頭(tou)，封板(ban)膜(※)及(ji)潔凈塑(su)料容(rong)器(qi)。

　　6. 濃縮(suo)生物(wu)素化(hua)抗體和濃縮(suo)酶結(jie)合物(wu)的(de)體積較(jiao)少(shao)，在(zai)運輸過(guo)程中(zhong)微(wei)量液體會(hui)沾到(dao)管(guan)壁及(ji)瓶(ping)蓋(gai)上(shang)，使(shi)用前(qian)請離(li)心(xin)處理(5-10 S 即(ji)可)，使(shi)管壁上的液體集(ji)中(zhong)在管底(di)部(bu)，取用(yong)時，請用移液器(qi)小(xiao)心(xin)吹打幾次(ci)。

　　7. 除了試劑(ji)盒(he)中(zhong)的濃縮(suo)洗滌液和終(zhong)止(zhi)液可(ke)以通(tong)用(yong)外，請不要使用其他來(lai)源(yuan)試劑(ji)盒(he)內(nei)含(han)的試(shi)劑(ji)代替(ti)本試劑(ji)盒(he)中(zhong)的某(mou)單(dan)個(ge)組分(fen)。

　　8. 為保證結果(guo)準確，每次(ci)檢(jian)測(ce)均需做(zuo)標(biao)準曲線。

　　安(an)全提示(shi)：

　　試(shi)劑(ji)盒(he)中(zhong)的終止液為酸(suan)性(xing)溶液，操作(zuo)人員(yuan)在使(shi)用(yong)時請帶上手套(tao)並(bing)註意(yi)防護;在操

　　作(zuo)過(guo)程中(zhong)也要避免(mian)試(shi)劑(ji)接觸皮膚(fu)和眼(yan)睛(jing)，如(ru)果不慎(shen)接觸，請用大量清(qing)水清(qing)洗;檢(jian)測(ce)血(xue)液樣(yang)本及(ji)其(qi)它(ta)體液樣(yang)本時，請按(an)國家生物(wu)實驗(yan)室安全(quan)防護有關管(guan)理規定執(zhi)行(xing)。

　　試(shi)劑(ji)盒(he)組成(cheng)及(ji)儲(chu)存(cun)：

　　1 30 倍濃縮(suo)洗滌液 20ml×1 瓶(ping) ;

　　2 酶標(biao)試(shi)劑(ji) 6ml×1 瓶

　　3 酶標(biao)包(bao)被(bei)板(ban) 12 孔×8 條(tiao) ;

　　4 樣(yang)品(pin)稀釋液 6ml×1 瓶(ping)

　　5 顯(xian)色劑(ji)A 液 6ml×1 瓶(ping) ;

　　6 顯(xian)色劑(ji)B 液 6ml×1/瓶(ping)

　　7 終(zhong)止(zhi)液 6ml×1 瓶(ping);

　　8 標(biao)準品(pin)(48ng/ml) 0.5ml×1 瓶

　　9 標(biao)準品(pin)稀釋液 1.5ml×1 瓶(ping);

　　10 說(shuo)明(ming)書 1 份

　　11 封板(ban)膜 2 張(zhang); 12 密封(feng)袋 1 個

　　自(zi)備實(shi)驗(yan)器材(cai)(不提供，可代購)

　　1. 酶標(biao)儀(yi)(主(zhu)波長 450nm，參考波長 630nm)

　　2. 高(gao)精(jing)度(du)移液器(qi)及(ji)壹(yi)次(ci)性(xing)吸(xi)頭(tou)：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

　　3. 洗板(ban)機或洗瓶(ping)

　　4. 37℃孵育箱(xiang)

　　5. 雙(shuang)蒸(zheng)水，去(qu)離(li)子水，量筒等

　　6. 稀釋用(yong)聚(ju)丙(bing)烯(xi)試(shi)管(guan)

　　樣(yang)本收集(ji)及(ji)儲(chu)存(cun)：

　　1. 細胞(bao)培(pei)養上(shang)清(qing)：

　　將(jiang)細(xi)胞(bao)培(pei)養基(ji)移至(zhi)無(wu)菌(jun)離(li)心(xin)管，在(zai) 4℃條件(jian)下(xia) 1000×g 離(li)心(xin) 10 min,然後(hou)將(jiang)上(shang)清(qing)等量分裝(zhuang)於(yu)小 EP 管(guan)並於(yu)-20℃下保存(cun)(24 小時內(nei)檢(jian)測(ce)可(ke)放(fang)入(ru) 2-8℃儲存(cun))，避免(mian)反(fan)復凍融。

　　2. 血(xue)清(qing)樣本：

　　室溫(wen)血(xue)液自(zi)然凝固 20 min 後(hou)，在 4℃條(tiao)件(jian)下(xia) 1000×g 離(li)心(xin) 10 min，然後(hou)將(jiang)上(shang)清(qing)等量分裝(zhuang)於(yu)小 EP 管(guan)並於(yu)-20℃下保存(cun)(24 小時內(nei)檢(jian)測(ce)可(ke)放(fang)入(ru) 2-8℃儲存(cun))，保存(cun)過(guo)程中(zhong)如有沈澱(dian)，請再(zai)次(ci)離(li)心(xin)，避免(mian)反(fan)復凍融。

　　3. 血(xue)漿樣(yang)本：

　　將(jiang)全(quan)血(xue)收集(ji)到(dao)含(han)抗血(xue)凝劑(ji)的管中(zhong)，根據標(biao)本的實(shi)際要求(qiu)選擇(ze) EDTA，檸(ning)檬(meng)酸(suan)鈉或肝素作(zuo)為抗凝劑(ji)，混合 20 min，在(zai) 4℃條(tiao)件(jian)下(xia) 1000×g 離(li)心(xin) 10 min，然後(hou)將(jiang)上(shang)清(qing)等量分裝(zhuang)於(yu)小EP 管(guan)並於(yu)-20℃下保存(cun)(24 小時內(nei)檢(jian)測(ce)可(ke)放(fang)入(ru) 2-8℃儲存(cun))，避免(mian)反(fan)復凍融。

　　註意(yi)：血(xue)清(qing)血(xue)漿樣(yang)本避免(mian)使(shi)用(yong)溶血(xue)、高(gao)血(xue)脂樣(yang)本，以免(mian)影(ying)響檢測(ce)結(jie)果(guo);如(ru)果(guo)樣本中的(de)靶(ba)標(biao)物(wu)檢(jian)測(ce)濃度(du)高(gao)於(yu)標(biao)準品(pin)的高(gao)值(zhi)，請將(jiang)樣(yang)品(pin)做適(shi)當倍數(shu)稀釋後(hou)檢(jian)測(ce)，建(jian)議正(zheng)式(shi)實驗(yan)前(qian)做預實(shi)驗(yan)以確(que)定稀釋倍數(shu)。

　　試(shi)劑(ji)準備：

　　1. 試(shi)劑(ji)回溫(wen)：首先(xian)在(zai)實(shi)驗前(qian) 30 min 將(jiang)試(shi)劑(ji)盒(he)，待(dai)測(ce)樣(yang)本放置(zhi)於(yu)室溫(wen)下，濃縮(suo)洗滌液如(ru)出現(xian)結晶(jing)，請放入(ru) 37℃溫(wen)浴直(zhi)到(dao)結(jie)晶全(quan)部(bu)溶解(jie)。

　　2. 配制洗滌液：預(yu)先(xian)計(ji)算(suan)好(hao)稀釋後(hou)的(de)洗滌液使(shi)用(yong)體積，然(ran)後用(yong)雙(shuang)蒸(zheng)水或去(qu)離(li)子水將(jiang) 20 倍濃縮(suo)洗滌液稀釋成(cheng) 1 倍應用(yong)液，未用完(wan)的濃縮(suo)洗滌液放(fang)入(ru) 4℃冰箱保存(cun)。

　　3. 標(biao)準品(pin)梯度(du)稀釋：加(jia)入(ru)標(biao)準品(pin)/樣本稀釋液(SR1)1ml至(zhi)凍(dong)幹標(biao)準品(pin)中，靜(jing)置(zhi)15分(fen)鐘(zhong)待其(qi)溶解(jie)後(hou)輕(qing)輕(qing)混勻(yun)(濃度(du)為2000pg/ml)，然後按(an)照以下(xia)濃度(du)：1000、 500、 250、125、62.5、31.25、 15.62 pg/ml進(jin)行(xing)2倍梯度(du)稀釋。1000pg/ml為標(biao)準曲線最(zui)高(gao)點(dian)，0pg/ml(即(ji)只添加(jia)標(biao)準品(pin)/樣本稀釋液(SR1))為標(biao)準曲線點(dian)。復溶過(guo)的標(biao)準品(pin)原液(2000pg/ml)未用完(wan)的應廢棄(qi)或根(gen)據需要按(an)照壹(yi)次(ci)用(yong)量分裝(zhuang)，復溶過(guo)的標(biao)準品(pin)原液(1000pg/ml)未用完(wan)的應廢棄(qi)或根(gen)據需要按(an)照壹(yi)次(ci)用(yong)量分裝(zhuang)，並將(jiang)其(qi)貯(zhu)存(cun)在-20～-80℃冰(bing)箱(xiang)，具(ju)體如下(xia)圖。

　　4. 生物(wu)素(su)化抗(kang)體工(gong)作(zuo)液：預(yu)先(xian)計(ji)算(suan)好(hao)試(shi)驗(yan)所(suo)需用(yong)量，用檢測(ce)稀釋液(SR2)將(jiang)100倍抗(kang)體濃縮(suo)液稀釋成(cheng)1倍應用(yong)工(gong)作(zuo)液(稀釋前(qian)充分混勻(yun))，請在30分(fen)鐘(zhong)內加(jia)入(ru)到(dao)反(fan)應孔中(zhong)。

　　5. 酶結(jie)合物(wu)工(gong)作(zuo)液：按(an)每次(ci)試(shi)驗(yan)所需用(yong)量配制，用酶結(jie)合物(wu)稀釋液(SR3)將(jiang)100倍濃縮(suo)酶結(jie)合物(wu)稀釋成(cheng)1倍應用(yong)工(gong)作(zuo)液(稀釋前(qian)離(li)心(xin))，請在30分(fen)鐘(zhong)內使(shi)用(yong)。

　　6. 標(biao)本預處(chu)理:

　　血(xue)清(qing)或血(xue)漿標(biao)本激(ji)活(huo)方(fang)法(fa):

　　1). 在(zai)225μl標(biao)準品(pin)/標(biao)本稀釋液(1b)中(zhong)，加(jia)入(ru)5μl血(xue)清(qing)或血(xue)漿標(biao)本。

　　2). 加10μl 1 N HCl，蓋(gai)緊，上(shang)下(xia)混勻(yun)。2-8℃放(fang)置(zhi)60±2分(fen)鐘(zhong)。

　　3). 加10μl 1 N NaOH，蓋(gai)緊(jin)，上(shang)下混勻(yun)。(總(zong)體積250μl即(ji)50倍稀釋)

　　4). 即(ji)用，或置(zhi)-20/-70℃可(ke)保存(cun)3天。計(ji)算(suan)結(jie)果(guo)時應乘(cheng)以稀釋倍數(shu)。

　　(註意(yi)：不同的標(biao)本TGF-β1的水(shui)平可(ke)能有較大差(cha)異(yi)，請根據實際情(qing)況(kuang)靈活(huo)掌握(wo)稀釋度(du))

　　細胞(bao)培(pei)養上(shang)清(qing)標(biao)本激(ji)活(huo)方(fang)法(fa):

　　1). 在(zai)80μl標(biao)準品(pin)/標(biao)本稀釋液(1b)中(zhong)，加(jia)入(ru)100μl標(biao)本。

　　2). 加10μl 1N HCl，蓋(gai)緊，上(shang)下(xia)混勻(yun)。2-8℃放(fang)置(zhi)60±2分(fen)鐘(zhong). 3). 加10μl 1N NaOH，蓋(gai)緊(jin)，上(shang)下混勻(yun)。(總(zong)體積200μl即(ji)2倍稀釋)。

　　4). 即(ji)用，或置(zhi)-20/-70℃可(ke)保存(cun)3天。計(ji)算(suan)結(jie)果(guo)時應乘(cheng)以稀釋倍數(shu)。. (註意(yi)：不同的標(biao)本TGF-β1的水(shui)平可(ke)能有較大差(cha)異(yi)，請根據實際情(qing)況(kuang)靈活(huo)掌握(wo)稀釋度(du))

　　7. 洗滌方(fang)法(fa)：

　　自(zi)動(dong)洗板(ban)：甩(shuai)盡酶標(biao)板(ban)孔中(zhong)液體，在厚(hou)叠吸(xi)水(shui)紙(zhi)上(shang)拍幹(gan)，註入(ru)洗滌液為 300ul/

　　孔,註與(yu)吸(xi)出間(jian)隔(ge)為 30 秒(miao)，洗板(ban) 5 次(ci)。

　　手工(gong)洗板(ban)：甩(shuai)盡酶標(biao)板(ban)孔中(zhong)液體，在厚(hou)叠吸(xi)水(shui)紙(zhi)上(shang)拍幹(gan)，用洗瓶(ping)加(jia)入(ru)洗滌液

　　300ul/孔，靜(jing)止(zhi) 30 秒(miao)後(hou)甩(shuai)凈酶標(biao)板(ban)孔中(zhong)液體，在厚(hou)叠的(de)吸(xi)水(shui)紙(zhi)上拍(pai)幹，洗板(ban) 5 次(ci)。

　　結(jie)果(guo)判斷：

　　1.用酶標(biao)儀(yi) 450 nm 波長測(ce)定 OD 值(zhi)。選擇(ze)雙波長檢(jian)測(ce)，參考波長為 630 nm。如不能進(jin)行(xing)雙(shuang)波長檢(jian)測(ce)，請用 450 nm 的(de) OD 測(ce)定值(zhi)減(jian)去 630 nm 的(de) OD 測(ce)定值(zhi)。

　　2.計算(suan)標(biao)準品(pin)、樣品(pin)的平均 OD 值(zhi)：每個標(biao)準品(pin)和標(biao)本的 OD 值(zhi)應減(jian)去零(ling)孔的(de) OD 值(zhi)。

　　3.以標(biao)準品(pin)濃度(du)為橫坐(zuo)標(biao)，吸(xi)光度(du)OD值(zhi)為縱坐(zuo)標(biao)，用(yong)軟件(jian)繪(hui)制(zhi)標(biao)準曲線，樣(yang)品(pin)中TGF-β1含(han)量可通過(guo)對應OD值(zhi)由標(biao)準曲線換算(suan)出相應的(de)濃度(du)。

　　4.若(ruo)標(biao)本 OD 值(zhi)高(gao)於(yu)標(biao)準曲線上(shang)限(xian)，應做(zuo)適(shi)當稀釋後(hou)重(zhong)新(xin)檢(jian)測(ce)，計(ji)算(suan)濃度(du)時再(zai)乘(cheng)以稀釋倍數(shu)。

　　2. 靈(ling)敏(min)度(du)：

　　可檢(jian)測(ce)小(xiao)鼠(shu) TGF-β1 濃度(du)達 8pg/ml，

　　20 個(ge)零標(biao)準品(pin)濃度(du) OD 的平(ping)均值(zhi)加上(shang)兩個(ge)標(biao)準差，計算(suan)相應的(de)可(ke)檢測(ce)濃度(du)。

　　3. 特異(yi)性(xing)：

　　不與(yu)小(xiao)鼠 TGF-β RI/Fc Chimera 反應，人的(de) TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 等反(fan)應

　　4. 重(zhong)復性(xing)：

　　板(ban)內，板(ban)間(jian)變異系數(shu)<10%

　　5. 回收(shou)率：

　　在選取(qu)的健康(kang)小(xiao)鼠(shu)血(xue)漿、細(xi)胞(bao)培(pei)養上(shang)清(qing)中加(jia)入(ru) 3 個不同濃度(du)水平(ping)的小鼠 TGF-β1，計算(suan)回收(shou)率。

　　6. 線性(xing)稀釋：

　　分(fen)別(bie)在選(xuan)取的 4 份健康(kang)小(xiao)鼠血(xue)漿和細(xi)胞(bao)培(pei)養上(shang)清(qing)中加(jia)入(ru)高(gao)濃度(du)小鼠(shu) TGF-β1，在標(biao)準曲線動(dong)力學範圍內(nei)進(jin)行(xing)稀釋，評(ping)估(gu)線(xian)性(xing)。

　　小(xiao)鼠(shu)轉(zhuan)化生長因(yin)子β1 ELISA試劑(ji)盒(he) 本生壹(yi)直(zhi)視(shi)質(zhi)量控(kong)制(zhi)為企(qi)業(ye)的生命(ming)，追求(qiu)企(qi)業(ye)競爭力的(de)不斷提升。公司在經(jing)營中始(shi)終(zhong)秉(bing)承(cheng)：遵紀守法(fa)，嚴於(yu)律(lv)己，寬(kuan)仁(ren)以待(dai)，敢(gan)於(yu)承擔(dan)的企(qi)業(ye)精(jing)神(shen)作(zuo)為標(biao)準，以過(guo)硬(ying)的質量和優(you)良(liang)的(de)服(fu)務(wu)來(lai)維護和拓(tuo)展市場，較大限(xian)度(du)的滿足(zu)客戶(hu)的(de)需求(qiu)。與(yu)客(ke)戶的共贏(ying)，是(shi)我(wo)們的(de)發展目標(biao)。本生!您(nin)信任(ren)的(de)合作(zuo)夥(huo)伴。我(wo)們願與(yu)您(nin)真(zhen)誠合作(zuo)，共(gong)創(chuang)美好(hao)的未來(lai)。