本生小課堂(tang)：小分子(zi)ELISA試劑(ji)盒(he)的標曲制(zhi)作(zuo)

　　小(xiao)分子(zi)抗原(yuan)或半抗原(yuan)因(yin)缺(que)乏(fa)可(ke)用於夾心法(fa)的兩個或兩個以上的不(bu)同位(wei)點(dian)，因此不(bu)能(neng)用雙抗體(ti)夾心法(fa)進行(xing)測(ce)定(ding)，可(ke)采(cai)用競爭(zheng)ELISA法(fa)模(mo)式(shi)。檢測(ce)原(yuan)理(li)是(shi)待(dai)測(ce)樣本中(zhong)的抗原(yuan)和壹(yi)定量的酶標抗原(yuan)競(jing)爭(zheng)與固相抗體(ti)結合。樣本中(zhong)抗原(yuan)含(han)量(liang)愈(yu)多(duo)，結(jie)合在固相上的酶標抗原(yuan)愈(yu)少(shao)，最(zui)後(hou)的顯(xian)色(se)也(ye)愈淺(qian)。小(xiao)分子(zi)激(ji)素、藥物(wu)等(deng)的ELISA測(ce)定(ding)多(duo)用競爭(zheng)法(fa)。

　　實例講述

　　嘔吐(tu)毒(du)素(su)(DON)是(shi)其中(zhong)最重(zhong)要壹種(zhong)毒(du)素，主(zhu)要來(lai)自(zi)鐮(lian)刀菌屬(shu)，尤其是禾(he)谷(gu)鐮(lian)刀菌和黃(huang)色鐮(lian)刀菌。由於它可(ke)以(yi)引起(qi)豬(zhu)的嘔吐(tu)，故(gu)又(you)名嘔(ou)吐(tu)毒(du)素(su)(vomitoxin，VT)。DON廣泛存在於全(quan)球(qiu)，主要汙染小麥(mai)、大麥(mai)、玉(yu)米等(deng)谷(gu)類作(zuo)物(wu)，也(ye)汙染糧食(shi)制(zhi)品(pin)，人畜(chu)攝入被(bei)DON汙染的食(shi)物(wu)、飼料(liao)後(hou)，會(hui)導致厭食(shi)、嘔(ou)吐(tu)、腹(fu)瀉(xie)、發(fa)燒、站(zhan)立(li)不(bu)穩(wen)、反應(ying)遲鈍等急(ji)性中(zhong)毒癥(zheng)狀，嚴(yan)重時損(sun)害造(zao)血系統造(zao)成死(si)亡。HPLC等檢測(ce)方(fang)法(fa)前(qian)處(chu)理步(bu)驟繁瑣且(qie)費(fei)用昂(ang)貴(gui)，ELISA方(fang)法(fa)具(ju)有(you)靈敏(min)度高(gao)，特(te)異(yi)性強，樣品(pin)前(qian)處(chu)理相(xiang)對(dui)簡(jian)單(dan)等(deng)特(te)點(dian)，可經(jing)濟(ji)、快速地檢測(ce)大(da)量(liang)樣品(pin)。

　　檢測(ce)原(yuan)理(li)

　　自(zi)主(zhu)研(yan)發(fa)的嘔吐(tu)毒(du)素(su)(DON)ELISA試劑(ji)盒(he)采(cai)用間接競(jing)爭(zheng)ELISA方(fang)法(fa)。首先(xian)將(jiang)嘔(ou)吐(tu)毒(du)素(su)抗原(yuan)結(jie)合(he)到(dao)酶標板(ban)微孔(kong)條(tiao)上，實驗時(shi)樣品(pin)或標準品的嘔吐(tu)毒(du)素(su)與(yu)包被(bei)的嘔吐(tu)毒(du)素(su)抗原(yuan)競(jing)爭(zheng)生物(wu)素(su)標記的抗嘔(ou)吐(tu)毒(du)素(su)單(dan)抗上(shang)的結合位(wei)點(dian)，遊離(li)的成分被(bei)洗(xi)去。加入辣根(gen)過(guo)氧化(hua)物(wu)酶(mei)標記的親和素(su)，生物(wu)素(su)與親和素(su)特異性結合(he)而形成免(mian)疫(yi)復(fu)合物(wu)，遊(you)離(li)的成分被(bei)洗(xi)去。加入顯(xian)色(se)底(di)物(wu)(TMB)，TMB在辣根(gen)過(guo)氧化(hua)物(wu)酶(mei)的催(cui)化(hua)下(xia)呈現(xian)藍(lan)色(se)，加終止液(ye)後(hou)變(bian)成黃色(se)。用酶標儀在450nm波長(chang)處(chu)測(ce)OD值(zhi)，嘔(ou)吐(tu)毒(du)素(su)濃度與OD450值(zhi)之(zhi)間呈反比(bi)，樣本吸(xi)光(guang)值(zhi)與(yu)其含有(you)的嘔吐(tu)毒(du)素(su)成負相(xiang)關(guan)。

　　數據分析

　　競(jing)爭(zheng)ELISA法(fa)的結果判定有(you)兩種(zhong)方(fang)法(fa)，粗略(lve)判定可(ke)用第(di)壹種(zhong)定(ding)性分析方(fang)法(fa)，而定量(liang)判定用第(di)二種(zhong)方(fang)法(fa)。競爭(zheng)ELISA法(fa)的標曲制(zhi)作(zuo)和濃度計算與(yu)雙抗體(ti)夾心法(fa)ELISA試劑(ji)盒(he)明顯(xian)不(bu)同，具(ju)體(ti)詳細說明如(ru)下：

　　定(ding)性分析

　　用樣本的平(ping)均(jun)吸(xi)光(guang)度值(zhi)與(yu)標準值(zhi)比(bi)較(jiao)即可(ke)得(de)出(chu)其濃度範(fan)圍(ppb)。假(jia)設樣本1的吸(xi)光(guang)度值(zhi)為0.527，樣本2的吸(xi)光(guang)度值(zhi)為1.225，標準品吸(xi)光(guang)度值(zhi)分別是：0ppb為2.044;5 ppb為1.758;15 ppb為1.368;45 ppb為0.783;135 ppb為0.287;405 ppb為0.092。則樣本1的濃度範(fan)圍是45ppb～135 ppb;樣本2的濃度範(fan)圍是15 ppb～45 ppb，再乘以其對(dui)應(ying)的稀(xi)釋(shi)倍(bei)數即可(ke)得(de)出(chu)樣本中(zhong)嘔吐(tu)毒(du)素(su)的濃度範(fan)圍。

　　定量分析

　　1、百(bai)分吸(xi)光(guang)率的計算

　　標準品或樣本的百分吸(xi)光(guang)率等(deng)於標準品或樣本的百分吸(xi)光(guang)度值(zhi)的平(ping)均(jun)值(zhi)(雙(shuang)孔(kong))除(chu)以(yi)第(di)壹個(ge)標準(0標準)的吸(xi)光(guang)度值(zhi)，再(zai)乘以100%，即

　　B—標準溶液(ye)或樣本溶液(ye)的平(ping)均(jun)吸(xi)光(guang)度值(zhi)

　　B0—0(ppb)標準溶液(ye)的平(ping)均(jun)吸(xi)光(guang)度值(zhi)

　　標準曲線的繪制(zhi)與(yu)計算

　　以(yi)標準品百分吸(xi)光(guang)率為縱坐(zuo)標，以嘔(ou)吐(tu)毒(du)素(su)(ppb)的對(dui)數為橫坐(zuo)標，【註意(yi)：標準曲線OD值(zhi)範(fan)圍需處(chu)於0-3之(zhi)間;標準曲線呈現(xian)出直(zhi)線或類似直(zhi)線形式(shi)，以增加標準曲線函數計算的擬合度，有(you)利(li)於提(ti)高(gao)樣本濃度測(ce)量(liang)準確(que)性】。本試劑(ji)盒(he)中(zhong)以嘔(ou)吐(tu)毒(du)素(su)(ppb)的半對(dui)數為橫坐(zuo)標，是依(yi)據標準液(ye)濃度分別是：0ppb;5 ppb;15 ppb;45 ppb;135 ppb;405 ppb，5 ppb-405 ppb濃度間呈現(xian)出後(hou)壹濃度為前(qian)壹濃度的3倍，進行(xing)對(dui)數計算

　　ELISA試劑(ji)盒(he) 本生壹直視質(zhi)量控制為企業(ye)的生命(ming)，追(zhui)求企業競(jing)爭(zheng)力的不(bu)斷(duan)提(ti)升。公司在經(jing)營(ying)中(zhong)始終秉承：遵(zun)紀守法(fa)，嚴於律(lv)己(ji)，寬(kuan)仁(ren)以(yi)待(dai)，敢(gan)於承擔的企業精神(shen)作(zuo)為標準，以過(guo)硬的質(zhi)量和優良的服務來(lai)維護和拓(tuo)展市場，較(jiao)大(da)限度的滿足客(ke)戶(hu)的需求。與(yu)客(ke)戶(hu)的共贏(ying)，是(shi)我(wo)們的發(fa)展目(mu)標。本生!您信任(ren)的合作(zuo)夥伴。我(wo)們願與(yu)您真(zhen)誠合作(zuo)，共創美(mei)好的未(wei)來(lai)。