標(biao)簽： 實(shi)時(shi) 熒光定量PCR realtime PCR  本生生物

所(suo)謂實(shi)時(shi)熒光定量 PCR 技(ji)術，是(shi)指(zhi)在 PCR 反(fan)應(ying)體(ti)系中(zhong)加入(ru)熒光基(ji)團，利用(yong)熒光信號積(ji)累實(shi)時監(jian)測整個 PCR 進程(cheng)，最(zui)後(hou)通過標準曲線(xian)對未(wei)知模(mo)板進行(xing)定量分(fen)析的方法(fa)。

原(yuan)理(li)及(ji)材料：

實驗材料：細(xi)胞樣(yang)品(pin)
試(shi)劑、試(shi)劑盒：RNA 提取(qu)試(shi)劑盒 熒光定量 PCR  MixTRIZOL dNTP lf 仿(fang) 逆轉錄(lu)酶(mei) MMLV ybc Taq 酶(mei) DEPC 水 ddH2O TE MgCl2 瓊脂(zhi)糖(tang) 溴化(hua)乙錠 MOPS jiaquan 乙酸(suan)鈉 EDTA EB 溴酚(fen)蘭(lan)    
儀(yi)器、耗材：離(li)心(xin)管(guan) 離(li)心(xin)機 風(feng)光光度計 電泳(yong)槽(cao) 凝膠板(ban) Realtime PCR 儀(yi)

實驗步(bu)驟(zhou):

壹(yi)、 樣品(pin) RNA 的抽提

1.  取(qu)凍存已裂解的細(xi)胞，室(shi)溫(wen)放(fang)置(zhi) 5 分(fen)鐘(zhong)使(shi)其(qi)溶(rong)解。

2.  兩(liang)相分(fen)離(li) 每(mei) 1 ml 的 TRIZOL 試(shi)劑裂解的樣品(pin)中(zhong)加入(ru) 0.2 ml 的 lf，蓋緊管蓋。手動(dong)劇烈(lie)振(zhen)蕩(dang)管(guan)體(ti) 15 秒(miao)後，15 到 30℃孵育 2 到 3 分鐘。4℃下(xia) 12 000 rpm 離(li)心(xin) 15 分(fen)鐘(zhong)。離(li)心(xin)後(hou)混合液(ye)體(ti)將(jiang)分(fen)為(wei)下(xia)層的紅色(se)酚(fen) lf 相，中(zhong)間(jian)層以及無色(se)水(shui)相上層。RNA 全(quan)部被分(fen)配(pei)於水(shui)相中(zhong)。水(shui)相上層的體(ti)積大(da)約是(shi)勻(yun)漿(jiang)時加入(ru)的 TRIZOL 試(shi)劑的 60%。

3.  RNA 沈(chen)澱(dian) 將(jiang)水(shui)相上層轉移到壹幹凈無 RNA 酶(mei)的離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)。加等(deng)體(ti)積 ybc 混合以沈(chen)澱(dian)其(qi)中(zhong)的 RNA，混勻(yun)後(hou) 15 到 30℃孵育 10 分鐘(zhong)後(hou)，於(yu) 4℃下(xia) 12 000 rpm 離(li)心(xin) 10 分(fen)鐘(zhong)。此(ci)時(shi)離(li)心(xin)前不可(ke)見的 RNA 沈(chen)澱(dian)將(jiang)在管底(di)部和(he)側壁(bi)上形成膠狀(zhuang)沈(chen)澱(dian)塊(kuai)。

4.  RNA 清洗 移去上清液(ye)，每(mei) 1 mlTRIZOL 試(shi)劑裂解的樣品(pin)中(zhong)加入(ru)至(zhi)少 1 ml 的 75% 乙醇（75% 乙醇用 DEPCH2O 配(pei)制(zhi)），清洗 RNA 沈(chen)澱(dian)。混勻(yun)後(hou)，4℃下(xia) 7 000 rpm 離(li)心(xin) 5 分(fen)鐘(zhong)。

5.  RNA 幹(gan)燥(zao) 小心(xin)吸去(qu)大(da)部分乙醇溶(rong)液(ye)，使(shi) RNA 沈(chen)澱(dian)在室溫(wen)空氣中(zhong)幹(gan)燥(zao) 5-10 分鐘(zhong)。

6.  溶(rong)解 RNA 沈(chen)澱(dian) 溶(rong)解 RNA 時(shi)，先(xian)加入(ru)無 RNA 酶(mei)的水 40μl 用(yong)槍(qiang)反(fan)復吹(chui)打(da)幾次(ci)，使(shi)其(qi)溶(rong)解，獲(huo)得(de)的 RNA 溶(rong)液(ye)保(bao)存於 - 80℃待用。

二、 RNA 質量檢測(ce)

1.  紫外(wai)吸收(shou)法(fa)測定(ding)

先(xian)用(yong)稀釋用的 TE 溶(rong)液(ye)將(jiang)分(fen)光光度計調(tiao)零(ling)。然(ran)後(hou)取(qu)少量 RNA 溶(rong)液(ye)用(yong) TE 稀釋（1:100）後，讀(du)取(qu)其(qi)在分光光度計 260nm 和(he) 280nm 處的吸收(shou)值(zhi)，測定 RNA 溶(rong)液(ye) 濃(nong)度和(he)純(chun)度(du)。

（1）濃(nong)度(du)測定

A260 下(xia)讀(du)值(zhi)為(wei) 1 表(biao)示 40 μg RNA/ml。樣(yang)品(pin) RNA 濃度(du) (μg/ml) 計(ji)算公(gong)式(shi)為(wei)：A260 × 稀釋倍數 × 40 μg/ml。具(ju)體(ti)計算(suan)如(ru)下(xia)：
RNA 溶(rong)於 40 μl DEPC 水(shui)中(zhong)，取(qu) 5 μl，1:100 稀釋至 495 μl 的 TE 中(zhong)，測(ce)得(de) A260 = 0.21
RNA 濃度(du) = 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取(qu) 5 ul 用(yong)來測量以(yi)後，剩余樣(yang)品(pin) RNA 為(wei) 35 μl，剩(sheng)余 RNA 總(zong)量為(wei)：
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

（2）純(chun)度(du)檢測(ce)

RNA 溶(rong)液(ye)的 A260/A280 的比值(zhi)即為(wei) RNA 純(chun)度(du)，比(bi)值(zhi)範(fan)圍(wei) 1.8 到 2.1。

2.  變性瓊脂(zhi)糖(tang)凝膠電泳(yong)測定

（1）制(zhi)膠(jiao)

1 g 瓊脂(zhi)糖(tang)溶(rong)於 72 ml 水(shui)中(zhong)，冷(leng)卻至(zhi) 60℃，10 ml 的 10× MOPS 電泳(yong)緩沖(chong)液(ye)和(he) 18 ml 的 37% jq 溶(rong)液(ye) (12.3 M)。
10×MOPS 電泳(yong)緩沖(chong)液(ye)
濃(nong)度  成分
0.4 M  MOPS，pH 7.0
0.1 M  乙酸(suan)鈉
0.01 M  EDTA

灌(guan)制(zhi)凝膠板(ban)，預留(liu)加樣(yang)孔至少可以加入(ru) 25 μl 溶(rong)液(ye)。膠(jiao)凝後取(qu)下(xia)梳(shu)子(zi)，將(jiang)凝膠板(ban)放(fang)入(ru)電泳(yong)槽(cao)內，加足(zu)量的 1×MOPS 電泳(yong)緩沖(chong)液(ye)至(zhi)覆(fu)蓋膠(jiao)面幾(ji)個毫(hao)米。

（2）準(zhun)備 RNA 樣品(pin)

取(qu) 3 μgRNA，加 3 倍(bei)體(ti)積的 jq 上樣染液(ye)，加 EB 於(yu) jq 上樣染液(ye)中(zhong)至(zhi)終濃(nong)度(du)為(wei) 10 μg/ml。加熱至 70℃孵(fu)育(yu) 15 分鐘使(shi)樣(yang)品(pin)變性(xing)。

（3）電泳(yong)

上樣前凝膠須(xu)預電泳(yong) 5 min，隨後將(jiang)樣(yang)品(pin)加入(ru)上樣孔。5-6 V/cm 電壓(ya)下(xia) 2 h，電泳(yong)至溴酚蘭(lan)指(zhi)示(shi)劑進膠(jiao)至少 2-3 cm。

（4）紫外(wai)透射光下(xia)觀察並拍照(zhao)

28S 和(he) 18S 核糖(tang)體(ti) RNA 的帶非常亮而濃(nong)（其(qi)大(da)小決定於(yu)用於(yu)抽提 RNA 的物種類型(xing)），上面壹條帶的密度(du)大(da)約是(shi)下(xia)面(mian)壹條帶的 2 倍。還有可能(neng)觀察到壹個更(geng)小稍(shao)微擴(kuo)散的帶，它(ta)由低分(fen)子(zi)量的 RNA（tRNA 和(he) 5S 核糖(tang)體(ti) RNA）組成。在 18S 和(he) 28S 核糖(tang)體(ti)帶之(zhi)間(jian)可(ke)以(yi)看(kan)到壹片彌(mi)散(san)的 EB 染色(se)物質，可能(neng)是(shi)由(you) mRNA 和(he)其(qi)它(ta)異(yi)型(xing) RNA 組成。RNA 制(zhi)備過程中(zhong)如(ru)果(guo)出(chu)現(xian) DNA 汙(wu)染(ran)，將(jiang)會在 28S 核糖(tang)體(ti) RNA 帶的上面出(chu)現(xian)，即更(geng)高分子(zi)量的彌(mi)散(san)遷(qian)移物質或者帶，RNA 的降解表(biao)現(xian)為(wei)核糖(tang)體(ti) RNA 帶的彌(mi)散(san)。用(yong)數碼(ma)照(zhao)相機拍下(xia)電泳(yong)結(jie)果(guo)。

三(san)、樣(yang)品(pin) cDNA 合成

1.  反(fan)應(ying)體(ti)系

序(xu)號(hao)          反(fan)應(ying)物           劑量

1          逆(ni)轉錄(lu) buffer       2 μl

2         上遊引(yin)物              0.2 μl

3         下(xia)遊(you)引(yin)物              0.2 μl

4          dNTP                   0.1 μl
5       逆轉錄(lu)酶(mei) MMLV     0.5 μl
6         DEPC 水              5 μl
7          RNA 模版(ban)            2 μl
8           總體(ti)積               10 μl

輕(qing)彈(dan)管底(di)將(jiang)溶(rong)液(ye)混合，6 000 rpm 短暫(zan)離(li)心(xin)。

2.  混合液(ye)在加入(ru)逆(ni)轉錄(lu)酶(mei) MMLV 之(zhi)前先(xian) 70℃幹(gan)浴(yu) 3 分(fen)鐘，取(qu)出(chu)後立即(ji)冰(bing)水浴(yu)至(zhi)管內外(wai)溫(wen)度(du)壹(yi)致(zhi)，然後加逆(ni)轉錄(lu)酶(mei) 0.5 μl，37℃水浴(yu) 60 分(fen)鐘。

3.  取(qu)出(chu)後立即(ji) 95℃幹(gan)浴(yu) 3 分(fen)鐘，得到逆轉錄(lu)終溶(rong)液(ye)即(ji)為(wei) cDNA 溶(rong)液(ye)，保(bao)存於 - 80℃待用。

四(si)、 梯度(du)稀釋的標準(zhun)品(pin)及待測樣品(pin)的管家(jia)基(ji)因（β-actin）實時定量 PCR

1.  β-actin 陽(yang)性(xing)模(mo)板的標準(zhun)梯(ti)度制(zhi)備 陽(yang)性(xing)模(mo)板的濃度(du)為(wei) 1011，反(fan)應(ying)前取(qu) 3 μl 按(an) 10 倍稀釋（加水(shui) 27 μl 並充分混勻(yun)）為(wei) 1010，依(yi)次(ci)稀釋至 109、108、107、106、105、104，以備用。

2.  反(fan)應(ying)體(ti)系如(ru)下(xia)：

標(biao)準品(pin)反(fan)應(ying)體(ti)系

序(xu)號(hao)           反(fan)應(ying)物                           劑量
1       SYBR Green 1 染(ran)料             10 μl
2       陽(yang)性(xing)模(mo)板上遊引(yin)物 F              0.5 μl
3      陽(yang)性(xing)模(mo)板下(xia)遊(you)引(yin)物 R              0.5 μl
4                dNTP                            0.5 μl
5                 Taq 酶(mei)                           1 μl
6           陽(yang)性(xing)模(mo)板 DNA                    5 μl
7              ddH2O                            32.5 μl
8               總體(ti)積                            50 μl

輕(qing)彈(dan)管底(di)將(jiang)溶(rong)液(ye)混合，6 000 rpm 短暫(zan)離(li)心(xin)。

3.  管(guan)家(jia)基(ji)因反(fan)應(ying)體(ti)系：

序(xu)號(hao)            反(fan)應(ying)物                                劑量
1      SYBR Green 1 染(ran)料                   10 μl
2      內參照(zhao)上遊引(yin)物 F                         0.5 μl
3     內參照(zhao)下(xia)遊(you)引(yin)物 R                         0.5 μl
4               dNTP                                    0.5 μl
5               Taq 酶(mei)                                   1 μl
6      待測樣品(pin) cDNA                             5 μl
7              ddH2O                                  32.5 μl
8             總體(ti)積                                    50 μl

輕(qing)彈(dan)管底(di)將(jiang)溶(rong)液(ye)混合， 6000 rpm 短暫(zan)離(li)心(xin)。

3.  制(zhi)備好的陽(yang)性(xing)標(biao)準品(pin)和(he)檢測(ce)樣(yang)本同時上機，反(fan)應(ying)條件(jian)為(wei)：93℃ 2 分(fen)鐘，然(ran)後 93℃ 1 分(fen)鐘(zhong)，55℃ 2 分(fen)鐘，共 40 個循環。

五(wu)、 制(zhi)備用於繪制(zhi)梯(ti)度稀釋標準曲線(xian)的 DNA 模板(ban)

1.  針(zhen)對每(mei)壹需要測量的基(ji)因，選擇壹確(que)定(ding)表(biao)達(da)該(gai)基(ji)因的 cDNA 模板(ban)進行(xing) PCR 反(fan)應(ying)。

2.  反(fan)應(ying)體(ti)系

序(xu)號(hao)                     反(fan)應(ying)物                        劑量
1                     10× PCR 緩(huan)沖(chong)液(ye)            2.5 ul
2                           MgCl2 溶(rong)液(ye)              1.5 ul
3                           上遊引(yin)物 F                 0.5 ul
4                           下(xia)遊(you)引(yin)物 R                0.5 ul
5                            dNTP 混合液(ye)            3 ul
6                            Taq 聚合酶(mei)               1 ul
7                             cDNA                       1 ul
8                    加水(shui)至總體(ti)積為(wei)               25 ul

輕(qing)彈(dan)管底(di)將(jiang)溶(rong)液(ye)混合，6000rpm 短暫(zan)離(li)心(xin)。

35 個 PCR 循環（94℃1 分(fen)鐘(zhong)；55℃1 分鐘(zhong)；72℃1 分鐘）； 72?C 延(yan)伸 5 分(fen)鐘(zhong)。

（3）PCR 產物與(yu) DNA Ladder 在 2％瓊脂(zhi)糖(tang)凝膠電泳(yong)，溴化乙錠染色(se)，檢測(ce) PCR 產物是(shi)否(fou)為(wei)單(dan)壹特(te)異(yi)性(xing)擴(kuo)增條帶。

（4）將(jiang) PCR 產物進行(xing) 10 倍梯(ti)度稀釋：將(jiang) PCR 產物進行(xing) 10 倍梯(ti)度稀釋：設(she)定 PCR 產物濃度為(wei) 1×1010，依(yi)次(ci)稀釋至 109、108、107、106、105、104 幾個濃度(du)梯(ti)度。

六(liu)、 待測樣品(pin)的待測基(ji)因實時定量 PCR

1.  所(suo)有 cDNA 樣品(pin)分別(bie)配(pei)置(zhi)實(shi)時(shi)定(ding)量 PCR 反(fan)應(ying)體(ti)系。

2.  體(ti)系配(pei)置(zhi)如(ru)下(xia)：

序(xu)號             反(fan)應(ying)物                                劑量
1            SYBR Green 1 染(ran)料               10 ul
2                上遊引(yin)物                               1 ul
3                下(xia)遊(you)引(yin)物                               1 ul
4                  dNTP                                   1 ul
5              Taq 聚合酶(mei)                               2 ul
6             待測樣品(pin) cDNA                        5 ul
7                   ddH2O                              30 ul
8                   總體(ti)積                               50 ul

輕(qing)彈(dan)管底(di)將(jiang)溶(rong)液(ye)混合，6 000 rpm 短暫(zan)離(li)心(xin)。

（3）將(jiang)配(pei)制(zhi)好(hao)的 PCR 反(fan)應(ying)溶(rong)液(ye)置(zhi)於(yu) Realtime PCR 儀(yi)上進行(xing) PCR 擴(kuo)增反(fan)應(ying)。反(fan)應(ying)條件(jian)為(wei)：93℃ 2 分(fen)鐘預變(bian)性(xing)，然後按(an) 93℃ 1 分鐘，55℃1 分鐘，72℃1 分(fen)鐘(zhong)，共 40 做個循環，最(zui)後(hou) 72℃7 分鐘延(yan)伸。

七(qi)、 實(shi)時(shi)定量 PCR 使(shi)用引(yin)物列(lie)表(biao)

引(yin)物設(she)計軟(ruan)件(jian)：Primer Premier 5.0，並遵(zun)循以下(xia)原(yuan)則：引(yin)物與(yu)模板(ban)的序列(lie)緊密互(hu)補(bu)；引(yin)物與(yu)引(yin)物之(zhi)間(jian)避免形成穩定(ding)的二聚體(ti)或發夾結(jie)構(gou)；引(yin)物不在模板(ban)的非目的位點引(yin)發 DNA 聚合反(fan)應(ying) (即錯(cuo)配)。

八(ba)、電泳(yong)

各樣(yang)品(pin)的目的基(ji)因和(he)管家(jia)基(ji)因分別進行(xing) Realtime PCR 反(fan)應(ying)。PCR 產物與(yu) DNA Ladder 在 2％瓊脂(zhi)糖(tang)凝膠電泳(yong)，GoldView 染色，檢測(ce) PCR 產物是(shi)否(fou)為(wei)單(dan)壹特(te)異(yi)性(xing)擴(kuo)增條帶。

註(zhu)：僅(jin)供(gong)參考(kao)！