牛血(xue)清(qing)澱(dian)粉(fen)樣蛋(dan)白(bai)A（SAA）酶(mei)聯免疫(yi)分析(xi)試劑盒說明書(shu)

本試劑僅(jin)供研究(jiu)使用

目的：本(ben)試劑盒用於(yu)測定(ding)牛血(xue)清(qing)，血(xue)漿(jiang)及相關(guan)液體樣本(ben)中血(xue)清(qing)澱(dian)粉(fen)樣蛋(dan)白(bai)A(SAA)的含(han)量(liang)。

實驗原理：

本(ben)試劑盒應用雙(shuang)抗(kang)體(ti)夾(jia)心(xin)法測(ce)定(ding)標本(ben)中牛血(xue)清(qing)澱(dian)粉(fen)樣蛋(dan)白(bai)A(SAA)水平(ping)。用純化(hua)的牛血(xue)清(qing)澱(dian)粉(fen)樣蛋(dan)白(bai)A(SAA)抗(kang)體(ti)包被微(wei)孔(kong)板(ban)，制(zhi)成固相抗體(ti)，往(wang)包被單(dan)抗的微(wei)孔(kong)中依次(ci)加入血(xue)清(qing)澱(dian)粉(fen)樣蛋(dan)白(bai)A(SAA)，再(zai)與HRP標(biao)記的血(xue)清(qing)澱(dian)粉(fen)樣蛋(dan)白(bai)A(SAA)抗(kang)體(ti)結(jie)合，形成(cheng)抗(kang)體-抗原-酶標(biao)抗體復(fu)合(he)物(wu)，經(jing)過*洗滌(di)後(hou)加底物(wu)TMB顯(xian)色。TMB在HRP酶(mei)的催化(hua)下(xia)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)藍色(se)，並(bing)在酸(suan)的作(zuo)用下(xia)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)終的黃(huang)色(se)。顏色的深(shen)淺(qian)和樣品(pin)中的血(xue)清(qing)澱(dian)粉(fen)樣蛋(dan)白(bai)A(SAA)呈(cheng)正(zheng)相關(guan)。用酶(mei)標(biao)儀在450nm波(bo)長(chang)下(xia)測(ce)定(ding)吸(xi)光度(du)(OD值)，通(tong)過標(biao)準(zhun)曲線(xian)計算樣品(pin)中牛血(xue)清(qing)澱(dian)粉(fen)樣蛋(dan)白(bai)A(SAA)濃度(du)。

試劑盒組(zu)成(cheng)：

試劑盒組(zu)成(cheng)48孔(kong)配(pei)置(zhi)96孔配(pei)置(zhi)保存(cun)

說明書(shu)1份(fen)1份(fen)

封板(ban)膜2片(48)2片(96)

密封袋(dai)1個(ge)1個(ge)

酶標包被板(ban)1×481×962-8℃保存(cun)

標準(zhun)品(pin)：22.5μg/mL0.5ml×1瓶(ping)0.5ml×1瓶(ping)2-8℃保存(cun)

標準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液1.5ml×1瓶(ping)1.5ml×1瓶(ping)2-8℃保存(cun)

酶標(biao)試劑3 ml×1瓶(ping)6 ml×1瓶(ping)2-8℃保存(cun)

樣品(pin)稀釋(shi)液3 ml×1瓶(ping)6 ml×1瓶(ping)2-8℃保存(cun)

顯(xian)色劑A液3 ml×1瓶(ping)6 ml×1瓶(ping)2-8℃保存(cun)

顯(xian)色劑B液3 ml×1瓶(ping)6 ml×1瓶(ping)2-8℃保存(cun)

終止液3ml×1瓶(ping)6ml×1瓶(ping)2-8℃保存(cun)

濃縮(suo)洗滌(di)液(20ml×20倍)×1瓶(ping)(20ml×30倍)×1瓶(ping)2-8℃保存(cun)

牛血(xue)清(qing)澱(dian)粉(fen)樣蛋(dan)白(bai)A（SAA）酶(mei)聯免疫(yi)分析(xi)試劑盒說明書(shu)

樣本(ben)處(chu)理及要求：

1. 血(xue)清(qing)：室溫(wen)血(xue)液自然(ran)凝(ning)固(gu)10-20分(fen)鐘(zhong)，離心(xin)20分鐘(zhong)左(zuo)右(you)(2000-3000轉/分(fen))。仔細(xi)收(shou)集(ji)上(shang)清(qing)，保存(cun)過程中如出(chu)現沈(chen)澱(dian)，應再次(ci)離心(xin)。

2. 血(xue)漿(jiang)：應根(gen)據(ju)標本(ben)的要(yao)求(qiu)選擇EDTA或(huo)檸(ning)檬酸(suan)鈉作為抗凝劑，混合(he)10-20分(fen)鐘(zhong)後(hou)，離心(xin)20分鐘(zhong)左(zuo)右(you)(2000-3000轉/分(fen))。仔細(xi)收(shou)集(ji)上(shang)清(qing)，保存(cun)過程中如有沈(chen)澱(dian)形成(cheng)，應該再次(ci)離心(xin)。

3. 尿(niao)液：用無(wu)菌管收(shou)集(ji)，離心(xin)20分鐘(zhong)左(zuo)右(you)(2000-3000轉/分(fen))。仔細(xi)收(shou)集(ji)上(shang)清(qing)，保存(cun)過程中如有沈(chen)澱(dian)形成(cheng)，應再次(ci)離心(xin)。胸腹(fu)水、腦脊液參照(zhao)實行(xing)。

4. 細(xi)胞培養上(shang)清(qing)：檢測分泌(mi)性的成(cheng)份(fen)時，用無(wu)菌管收(shou)集(ji)。離心(xin)20分鐘(zhong)左(zuo)右(you)(2000-3000轉/分(fen))。仔細(xi)收(shou)集(ji)上(shang)清(qing)。檢測細(xi)胞內的成(cheng)份(fen)時，用PBS(PH7.2-7.4)稀釋(shi)細(xi)胞懸(xuan)液，細(xi)胞濃度(du)達(da)到100萬/ml左右。通(tong)過反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)，以(yi)使細(xi)胞破壞(huai)並放出(chu)細(xi)胞內成(cheng)份(fen)。離心(xin)20分鐘(zhong)左(zuo)右(you)(2000-3000轉/分(fen))。仔細(xi)收(shou)集(ji)上(shang)清(qing)。保存(cun)過程中如有沈(chen)澱(dian)形成(cheng)，應再次(ci)離心(xin)。

5. 組(zu)織標(biao)本(ben)：切(qie)割標本(ben)後(hou)，稱(cheng)取重(zhong)量(liang)。加入定(ding)量(liang)的PBS，PH7.4。用液氮(dan)迅速冷(leng)凍保存(cun)備用。標(biao)本(ben)融(rong)化(hua)後(hou)仍(reng)然(ran)保持2-8℃的溫(wen)度(du)。加入定(ding)量(liang)的PBS(PH7.4)，用手工或勻(yun)漿(jiang)器將標本勻(yun)漿(jiang)充(chong)分。離(li)心(xin)20分鐘(zhong)左(zuo)右(you)(2000-3000轉/分(fen))。仔細(xi)收(shou)集(ji)上(shang)清(qing)。分裝後(hou)份(fen)待檢(jian)測，其(qi)余冷(leng)凍備(bei)用。

6. 標(biao)本(ben)采(cai)集(ji)後(hou)盡早進行(xing)提(ti)取，提取按(an)相關(guan)文獻進(jin)行(xing)，提(ti)取後(hou)應盡快(kuai)進行(xing)實(shi)驗。若不能(neng)馬上(shang)進(jin)行(xing)試驗，可將標本放於(yu)-20℃保存(cun)，但應避免(mian)反復(fu)凍(dong)融(rong).

7. 不能(neng)檢測含NaN3的樣品(pin)，因NaN3抑(yi)制(zhi)辣根(gen)過氧(yang)化(hua)物(wu)酶的(HRP)活性。

操作(zuo)步(bu)驟

1. 標(biao)準(zhun)品(pin)的稀釋(shi)與加(jia)樣：在酶(mei)標(biao)包被板(ban)上(shang)設(she)標準(zhun)品(pin)孔(kong)10孔(kong)，在、第(di)二(er)孔中分別(bie)加標(biao)準(zhun)品(pin)100μl，然(ran)後(hou)在、第(di)二(er)孔中加標(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液50μl，混勻(yun);然(ran)後(hou)從孔、第二(er)孔中各取100μl分別(bie)加(jia)到第三孔和第四(si)孔(kong)，再在第(di)三、第四孔(kong)分(fen)別加(jia)標準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液50μl，混勻(yun);然(ran)後(hou)在第(di)三孔和第四(si)孔(kong)中先各(ge)取50μl棄(qi)掉(diao)，再各(ge)取50μl分別(bie)加(jia)到第五、第(di)六(liu)孔中，再在第(di)五、第(di)六(liu)孔中分別(bie)加標(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液50ul，混勻(yun);混勻(yun)後(hou)從第五、第(di)六(liu)孔中各取50μl分別(bie)加(jia)到第七(qi)、第(di)八孔(kong)中，再在第(di)七(qi)、第(di)八孔(kong)中分別(bie)加標(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液50μl，混勻(yun)後(hou)從第七(qi)、第(di)八孔(kong)中分別(bie)取50

μl加到第九(jiu)、第(di)十(shi)孔(kong)中，再在第(di)九(jiu)第(di)十(shi)孔(kong)分別加標(biao)準(zhun)品(pin)稀釋(shi)液50μl，混勻(yun)後(hou)從第九(jiu)第(di)十(shi)孔(kong)中各取50μl棄(qi)掉(diao)。(稀釋(shi)後(hou)各孔加樣量(liang)都為50μl，濃度(du)分別為15μg/mL，10μg/mL ，5μg/mL，2.5μg/mL， 1.25μg/mL)。

2. 加樣：分(fen)別(bie)設空白(bai)孔(kong)(空(kong)白(bai)對(dui)照(zhao)孔不加樣品(pin)及酶標試劑，其(qi)余各(ge)步(bu)操作(zuo)相同(tong))、待測(ce)樣品(pin)孔(kong)。在酶(mei)標(biao)包被板(ban)上(shang)待(dai)測樣品(pin)孔(kong)中先加(jia)樣品(pin)稀釋(shi)液40μl，然(ran)後(hou)再加待測樣品(pin)10μl(樣品(pin)終(zhong)稀釋(shi)度為5倍)。加樣將樣品(pin)加(jia)於(yu)酶標(biao)板孔(kong)底部，盡(jin)量(liang)不觸及孔壁，輕輕(qing)晃(huang)動混(hun)勻(yun)。

3. 溫育(yu)：用封(feng)板(ban)膜封板後(hou)置(zhi)37℃溫育(yu)30分(fen)鐘(zhong)。

4. 配液：將30(48T的20倍(bei))倍(bei)濃縮(suo)洗滌(di)液用蒸(zheng)餾(liu)水30(48T的20倍(bei))倍(bei)稀釋(shi)後(hou)備用。

5. 洗滌(di)：小(xiao)心(xin)揭掉(diao)封(feng)板(ban)膜，棄(qi)去(qu)液體，甩幹(gan)，每(mei)孔(kong)加滿洗滌(di)液，靜(jing)置(zhi)30後(hou)棄(qi)去(qu)，如此重(zhong)復(fu)5次(ci)，拍(pai)幹。

6. 加(jia)酶：每(mei)孔(kong)加入酶(mei)標(biao)試劑50μl，空(kong)白(bai)孔(kong)除(chu)外(wai)。

7. 溫(wen)育(yu)：操(cao)作同(tong)3。

8. 洗滌(di)：操作(zuo)同(tong)5。

9. 顯(xian)色：每(mei)孔(kong)先加入顯(xian)色劑A50μl，再加入顯(xian)色劑B50μl，輕輕震(zhen)蕩(dang)混(hun)勻(yun)，37℃避光(guang)顯(xian)色15分鐘.

10. 終止：每(mei)孔(kong)加終止液50μl，終止反(fan)應(此時藍色(se)立(li)轉黃(huang)色)。

11. 測定(ding)：以(yi)空白(bai)空(kong)調(tiao)零，450nm波長(chang)依(yi)序(xu)測量(liang)各孔的吸(xi)光度(du)(OD值)。 測(ce)定(ding)應在加(jia)終(zhong)止液後(hou)15分鐘以(yi)內進(jin)行(xing)。

註(zhu)意事(shi)項(xiang)：

1. 試劑盒從冷藏環(huan)境(jing)中取出(chu)應在室(shi)溫(wen)平(ping)衡15-30分(fen)鐘後(hou)方可使用，酶(mei)標(biao)包被板(ban)開封後(hou)如未(wei)用完(wan)，板(ban)條(tiao)應裝入密封袋(dai)中保存(cun)。

2. 濃洗滌(di)液可能(neng)會有結(jie)晶(jing)析(xi)出(chu)，稀釋(shi)時可在水浴中加溫(wen)助溶(rong)，洗滌(di)時不影響(xiang)結(jie)果(guo)。

3. 各(ge)步(bu)加樣均(jun)應使用加(jia)樣器(qi)，並(bing)經(jing)常(chang)校對(dui)其(qi)準(zhun)確性，以(yi)避免(mian)試驗誤(wu)差(cha)。次(ci)加樣時間控(kong)制(zhi)在5分(fen)鐘(zhong)內，如標本(ben)數(shu)量(liang)多，推薦使用排(pai)槍(qiang)加(jia)樣。

4. 請每(mei)次(ci)測定(ding)的同(tong)時做標(biao)準(zhun)曲線(xian)，做(zuo)復(fu)孔(kong)。如標本(ben)中待測(ce)物(wu)質含(han)量(liang)過高(樣本(ben)OD值大(da)於(yu)標準(zhun)品(pin)孔(kong)孔(kong)的OD值)，請先用樣品(pin)稀釋(shi)液稀釋(shi)定(ding)倍數(shu)(n倍(bei))後(hou)再測定(ding)，計算時請後(hou)乘以(yi)總(zong)稀釋(shi)倍數(shu)(×n×5)。

5. 封板膜只限次性使用，以(yi)避免(mian)交(jiao)叉(cha)汙(wu)染。

6. 底物(wu)請避光(guang)保存(cun)。

7. 嚴(yan)格(ge)按(an)照(zhao)說明書(shu)的操(cao)作(zuo)進行(xing)，試驗結(jie)果(guo)判(pan)定(ding)必(bi)須以(yi)酶標(biao)儀讀(du)數(shu)為準(zhun).

8. 所(suo)有樣品(pin)，洗滌(di)液和各種(zhong)廢(fei)棄(qi)物(wu)都應按(an)傳染物(wu)處理(li)。

9. 本試劑不同(tong)批號(hao)組(zu)分(fen)不得混(hun)用。

10. 如與英(ying)文說(shuo)明書(shu)有異(yi)，以(yi)英(ying)文說(shuo)明書(shu)為準(zhun)。

計算：

以(yi)標準(zhun)物(wu)的濃度(du)為橫坐標，OD值為縱(zong)坐標(biao)，在坐(zuo)標(biao)紙上(shang)繪(hui)出(chu)標(biao)準(zhun)曲線(xian)，根(gen)據(ju)樣品(pin)的OD值由(you)標(biao)準(zhun)曲線(xian)查(zha)出(chu)相應的濃度(du);再乘以(yi)稀釋(shi)倍數(shu);或用標(biao)準(zhun)物(wu)的濃度(du)與OD值計算出(chu)標(biao)準(zhun)曲線(xian)的直(zhi)線(xian)回歸(gui)方程式，將樣品(pin)的OD值代入方程式，計算出(chu)樣品(pin)濃度(du)，再乘以(yi)稀釋(shi)倍數(shu)，即(ji)為樣品(pin)的實(shi)際(ji)濃度(du)。(此圖僅(jin)供(gong)參考)試劑盒性能(neng)：

1.樣品(pin)線(xian)性回歸(gui)與預(yu)期(qi)濃度(du)相關(guan)系數R值為0.92以(yi)上(shang)。

2.批(pi)內與批(pi)見應分別(bie)小(xiao)於(yu)9%和15%

牛血(xue)清(qing)澱(dian)粉(fen)樣蛋(dan)白(bai)A（SAA）酶(mei)聯免疫(yi)分析(xi)試劑盒說明書(shu)

保存(cun)條(tiao)件及有效(xiao)期(qi)：

1.試劑盒保存(cun)：;2-8℃。

2.有效(xiao)期(qi)：6個(ge)月(yue)