ELISA各(ge)個(ge)操(cao)作(zuo)步驟(zhou)的(de)註意(yi)要(yao)點，珠(zhu)式、管(guan)式及(ji)磁性球ELSIA，國(guo)外(wai)試(shi)劑(ji)均(jun)與(yu)特(te)殊(shu)儀(yi)器(qi)配合應(ying)用，兩(liang)者均(jun)有(you)詳細(xi)的(de)使(shi)用說明(ming)，嚴(yan)格(ge)遵照規(gui)定(ding)操作(zuo)，必能得(de)出準(zhun)確(que)的(de)結果(guo)。

壹(yi)、標(biao)本(ben)的(de)采取和保(bao)存

可用作(zuo)ELISA測定(ding)的(de)標本(ben)十分(fen)廣(guang)泛，體(ti)液(如血(xue)清)、分泌(mi)物(wu)(唾液)和排泄(xie)物(wu)(如尿液、糞便(bian))等(deng)均可作(zuo)標本(ben)以測(ce)定其(qi)中某(mou)種(zhong)抗體(ti)或(huo)抗原成(cheng)份(fen)。有(you)些(xie)標(biao)本(ben)可直接進(jin)行(xing)測定(ding)(如血(xue)清、尿液)，有些(xie)則(ze)需經(jing)預(yu)處(chu)理(如糞(fen)便和某(mou)些分泌物(wu))。大部(bu)分ELISA檢(jian)測均以血(xue)清為(wei)標(biao)本(ben)。血漿中(zhong)除(chu)尚含(han)有纖(xian)維(wei)蛋(dan)白(bai)原和抗凝(ning)劑(ji)外，其(qi)他成(cheng)份(fen)均(jun)同等(deng)於血清。制(zhi)備(bei)血(xue)漿(jiang)標本需借助於抗凝(ning)劑(ji)，而血清(qing)標本(ben)只(zhi)要待(dai)血清(qing)自然凝固、即(ji)可取得。除(chu)特(te)殊(shu)情(qing)況(kuang)外(wai)，在(zai)醫(yi)學(xue)檢(jian)驗(yan)中(zhong)均(jun)以血(xue)清作(zuo)為(wei)檢(jian)測標本。在(zai)ELISA中血漿和血清(qing)可同等(deng)應(ying)用。血清(qing)標本(ben)可按(an)常規(gui)方(fang)法(fa)采集，應(ying)註意(yi)避(bi)免(mian)溶(rong)血(xue)，紅細(xi)胞溶(rong)解(jie)時會(hui)釋放出具(ju)有(you)過氧化(hua)物(wu)酶活性的(de)物(wu)質，以HRP為(wei)標(biao)記(ji)的(de)ELISA測定(ding)中，溶(rong)血(xue)標本可能會(hui)增加非(fei)特(te)異(yi)性顯色(se)。

血清標本宜(yi)在新(xin)鮮時檢(jian)測。如有(you)細(xi)菌(jun)汙(wu)染，菌(jun)體(ti)中(zhong)可能含(han)有內源(yuan)性HRP，也會(hui)產生假陽(yang)性反(fan)應(ying)。如在(zai)冰箱中保(bao)存過久，其(qi)中的(de)可發生聚(ju)合，在(zai)間(jian)接法ELISA中(zhong)可使(shi)本(ben)底(di)加深。壹(yi)般(ban)說來(lai)，在(zai)5天(tian)內測(ce)定(ding)的(de)血清(qing)標本(ben)可放置(zhi)於4℃，超過壹(yi)周(zhou)測(ce)定的(de)需低(di)溫冰(bing)存。凍(dong)結(jie)血清融(rong)解後(hou)，蛋(dan)白(bai)質局部(bu)濃(nong)縮，分布(bu)不(bu)均，應充分混勻宜(yi)輕緩(huan)，避(bi)免(mian)氣泡，可上(shang)下顛倒(dao)混和，不要(yao)在(zai)混勻器(qi)上(shang)強烈(lie)振(zhen)蕩。混濁或有沈澱(dian)的(de)血清(qing)標本(ben)應先(xian)離心或過濾，澄清後再(zai)檢(jian)測。反(fan)復(fu)凍(dong)融(rong)會(hui)使(shi)抗體(ti)效(xiao)價(jia)跌(die)落(luo)，所(suo)以測(ce)抗體(ti)的(de)血清(qing)標本(ben)如需(xu)保(bao)存作(zuo)多次(ci)檢(jian)測，宜(yi)少量分(fen)裝(zhuang)冰(bing)存。保(bao)存血(xue)清(qing)自采(cai)集(ji)時就應(ying)註意(yi)無菌(jun)操(cao)作(zuo)，也可加入適(shi)當防腐劑。

二(er)、試(shi)劑(ji)的(de)準(zhun)備(bei)

按(an)試(shi)劑(ji)盒(he)說明(ming)書的(de)要求(qiu)準(zhun)備(bei)實(shi)驗(yan)中(zhong)需(xu)用的(de)試(shi)劑(ji)。ELISA中(zhong)用的(de)蒸餾(liu)水(shui)或去(qu)離子水(shui)，包(bao)括用於洗滌的(de)，應為(wei)新(xin)鮮的(de)和高(gao)質(zhi)量的(de)。自配的(de)緩沖液應用pH計(ji)測量較正。從冰箱中取出的(de)試(shi)驗(yan)用試(shi)劑(ji)應(ying)待(dai)溫度與(yu)室溫(wen)平(ping)衡(heng)後使(shi)用。試(shi)劑(ji)盒(he)中本(ben)次(ci)試(shi)驗(yan)不(bu)需(xu)用的(de)部(bu)分應(ying)及(ji)時放回冰箱保(bao)存。

三(san)、加(jia)樣

在ELISA中(zhong)壹(yi)般(ban)有(you)3次(ci)加(jia)樣(yang)步(bu)聚(ju)，即加(jia)標本(ben)，加酶結合物(wu)，加底(di)物(wu)。加樣(yang)時應將所加物(wu)加在(zai)LEISA板孔(kong)的(de)底(di)部(bu)，避免(mian)加在孔壁上(shang)部(bu)，並(bing)註意(yi)不(bu)可濺(jian)出(chu)，不(bu)可產生氣泡。加(jia)標本(ben)壹(yi)般(ban)用微量加(jia)樣(yang)器(qi)，按(an)規定的(de)量加(jia)入板(ban)孔(kong)中。每(mei)次(ci)加(jia)標(biao)本(ben)應更換吸嘴，以免(mian)發生交叉(cha)汙(wu)染，也可用壹(yi)次(ci)性的(de)定量塑(su)料(liao)管(guan)加(jia)樣。有此測定(如間(jian)接法ELISA)需(xu)用稀釋的(de)血清(qing)，可在試(shi)管(guan)中(zhong)按(an)規定的(de)稀釋度稀(xi)釋後再(zai)加樣(yang)。也可在板(ban)孔中加(jia)入稀(xi)釋液，再(zai)在其(qi)中加(jia)入血(xue)清(qing)標本(ben)，然後在微型(xing)震蕩器(qi)上(shang)震(zhen)蕩1分鐘(zhong)以保(bao)證(zheng)混和。加酶結合物(wu)應用液和底(di)物(wu)應用液時可用定量多(duo)道加(jia)液器(qi)，使(shi)加(jia)液過程迅速(su)完(wan)成(cheng)。

四、保(bao)溫

在(zai)ELISA中(zhong)壹(yi)般(ban)有(you)兩(liang)次(ci)抗原抗體(ti)反(fan)應(ying)，即(ji)加標本(ben)和加酶結合物(wu)後。抗原抗體(ti)反(fan)應(ying)的(de)完(wan)成(cheng)需要有壹(yi)定(ding)的(de)溫度和時間，這壹(yi)保(bao)溫過程稱為(wei)溫(wen)育(yu)(incubation)，有(you)人(ren)稱之(zhi)為(wei)孵(fu)育(yu)，在(zai)ELISA中(zhong)似(si)不恰(qia)當。

ELISA屬(shu)固(gu)相(xiang)免(mian)疫(yi)測定，抗原、抗體(ti)的(de)結合只(zhi)在(zai)固相(xiang)表面上(shang)發(fa)生。以抗體(ti)包(bao)被的(de)夾心法為(wei)例(li)，加入板(ban)孔(kong)中的(de)標本(ben)，其(qi)中的(de)抗原並(bing)不是都有(you)均等(deng)的(de)和固相(xiang)抗結(jie)合的(de)機(ji)會(hui)，只有貼近(jin)孔壁的(de)壹(yi)層(ceng)溶(rong)液中的(de)抗原直接與(yu)抗體(ti)接觸(chu)。這是壹(yi)個(ge)逐(zhu)步平(ping)衡(heng)的(de)過程，因此需經(jing)擴散才能達(da)到(dao)反(fan)應(ying)的(de)終(zhong)點。在(zai)其(qi)後加(jia)入的(de)酶標記(ji)抗體(ti)與(yu)固相(xiang)抗原的(de)結合也(ye)同樣(yang)如此。這就是為(wei)什(shen)麽ELISA反(fan)應(ying)總(zong)是需(xu)要壹(yi)定(ding)時間的(de)溫育(yu)。

溫(wen)育(yu)常采(cai)用的(de)溫度有(you)43℃、37℃、室溫和4℃(冰箱溫度)等(deng)。37℃是實(shi)驗(yan)室(shi)中(zhong)常用的(de)保(bao)溫溫(wen)度，也(ye)是大(da)多數抗原抗體(ti)結(jie)合的(de)合適(shi)溫度。在(zai)建立(li)ELISA方法作(zuo)反(fan)應(ying)動(dong)力(li)學研(yan)究(jiu)時，實驗(yan)表(biao)明(ming)，兩(liang)次(ci)抗原抗體(ti)反(fan)應(ying)壹(yi)般(ban)在(zai)37℃經(jing)1-2小時，產物(wu)的(de)生成(cheng)可達(da)。為(wei)加(jia)速(su)反(fan)應(ying)，可提高(gao)反(fan)應(ying)的(de)溫度，有(you)些試(shi)驗(yan)在(zai)43℃進(jin)行(xing)，但不(bu)宜(yi)采用更高(gao)的(de)溫度。抗原抗體(ti)反(fan)應(ying)4℃更(geng)為(wei)*，在(zai)放(fang)射免(mian)疫測(ce)定中(zhong)多使(shi)反(fan)應(ying)在(zai)冰箱中過夜，以形(xing)成(cheng)多的(de)沈澱(dian)。但(dan)因(yin)所(suo)需時間太(tai)長，在(zai)ELISA中壹(yi)般(ban)不(bu)予(yu)采(cai)用。

保(bao)溫的(de)方式除有(you)的(de)ELISA儀器(qi)附(fu)有(you)特(te)制(zhi)的(de)電(dian)熱塊(kuai)外，壹(yi)般(ban)均(jun)采用水(shui)浴，可將ELISA板置(zhi)於水(shui)浴箱中，ELISA板(ban)底(di)應貼著水(shui)面，使(shi)溫(wen)度迅(xun)速平(ping)衡(heng)。為(wei)避(bi)免(mian)蒸發，板(ban)上(shang)應(ying)加(jia)蓋(gai)，也(ye)可用塑(su)料(liao)貼封紙(zhi)或保(bao)鮮膜(mo)覆蓋(gai)板(ban)孔，此時可讓反(fan)應(ying)板(ban)漂(piao)浮(fu)在(zai)水(shui)面上(shang)。若(ruo)用保(bao)溫箱，ELISA板應(ying)放在(zai)濕(shi)盒(he)內，濕(shi)盒(he)要選(xuan)用傳熱性良好(hao)的(de)材料(liao)如金(jin)屬(shu)等(deng)，在(zai)盒(he)底(di)墊(dian)濕的(de)紗布(bu)，後(hou)將ELISA板放在濕(shi)紗(sha)布(bu)上(shang)。濕(shi)盒(he)應先(xian)放在(zai)保(bao)溫箱中預(yu)溫(wen)至規(gui)定的(de)溫度，特(te)別(bie)是在(zai)氣溫較低的(de)時候(hou)更應(ying)如此。無論是水(shui)浴還是濕(shi)盒(he)溫育(yu)，反(fan)應(ying)板(ban)均不宜(yi)疊放(fang)，以保(bao)證(zheng)各板的(de)溫度都能迅(xun)速平(ping)衡(heng)。室溫溫(wen)育(yu)的(de)反(fan)應(ying)，操(cao)作(zuo)時的(de)室溫(wen)應嚴(yan)格(ge)限制(zhi)在規定(ding)的(de)範(fan)圍內，標(biao)準(zhun)室(shi)溫(wen)溫度是指(zhi)20-25℃，但(dan)具體操作(zuo)時可根據(ju)說明(ming)書的(de)要求(qiu)控(kong)制(zhi)溫育(yu)。室(shi)溫(wen)溫育(yu)時，ELISA板只(zhi)要平(ping)置(zhi)於操作(zuo)臺(tai)上(shang)即(ji)可。應註(zhu)意(yi)溫(wen)育(yu)的(de)溫度和時間應(ying)按(an)規定力(li)求準(zhun)確(que)。為(wei)保(bao)證(zheng)這壹(yi)點，壹(yi)個(ge)人(ren)操(cao)作(zuo)時，壹(yi)次(ci)不(bu)宜(yi)多於兩(liang)塊板同時測定(ding)。