熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR試(shi)劑(ji)盒(he)在(zai)實(shi)驗(yan)關鍵步(bu)驟(zhou)及(ji)註意(yi)事(shi)項(xiang)

　　以下是(shi)熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR(qPCR)試(shi)劑(ji)盒(he)實(shi)驗(yan)的關鍵步(bu)驟(zhou)及(ji)註意(yi)事(shi)項(xiang)，天(tian)津本(ben)生(sheng)結(jie)合操作(zuo)規(gui)範與常(chang)見(jian)問題(ti)解(jie)決(jue)方(fang)案(an)：

　　壹、實(shi)驗(yan)前(qian)準備(bei)‌

　　試(shi)劑(ji)與耗材(cai)‌

　　使用無(wu)RNase/DNase的(de)槍頭、EP管(guan)，避免(mian)RNA降解(jie)‌。

　　試(shi)劑(ji)盒(he)組(zu)分(fen)需提前(qian)平(ping)衡至(zhi)室(shi)溫(wen)(20-25℃)，避免(mian)溫(wen)度波(bo)動(dong)影(ying)響反應(ying)效率‌。

　　樣本(ben)處理(li)‌

　　RNA提取(qu)後需檢(jian)測濃(nong)度(A260/A280=1.8-2.0)及(ji)完(wan)整性(xing)(RIN≥7)‌。

　　反轉錄cDNA時(shi)需設置無(wu)模板對(dui)照(zhao)(NTC)和基(ji)因(yin)組(zu)DNA去(qu)除步(bu)驟(zhou)‌。

　　二(er)、反(fan)應(ying)體系配(pei)置‌

　　加樣順(shun)序(xu)‌

　　推(tui)薦(jian)先(xian)配(pei)制主反應混(hun)合液(含酶、dNTPs、緩(huan)沖(chong)液(ye)等(deng))，再(zai)分裝(zhuang)至(zhi)各孔，最(zui)後(hou)加入模板‌。

　　加樣誤差(cha)需<5%，避免(mian)交(jiao)叉(cha)汙染(如使用排(pai)槍或自動(dong)化(hua)工作(zuo)站(zhan))‌。

　　關鍵參數‌

　　引物終濃(nong)度通常(chang)為(wei)0.1-1μM，需通過(guo)梯(ti)度實(shi)驗(yan)優(you)化(hua)‌。

　　SYBR Green法需設置熔(rong)解(jie)曲(qu)線分析(xi)引(yin)物二聚(ju)體‌。

　　三(san)、儀(yi)器操作(zuo)‌

　　程(cheng)序(xu)設置‌

　　三(san)步(bu)法(fa)程(cheng)序(xu)：95℃預(yu)變性(xing)10分鐘(zhong)→(95℃ 15秒(miao)→60℃ 30秒(miao)→72℃ 30秒(miao))×40循(xun)環‌。

　　熒光(guang)信號(hao)采(cai)集(ji)需設置在(zai)退(tui)火/延伸階段(SYBR Green法(fa))或探(tan)針(zhen)結合階段(TaqMan法(fa))‌。

　　數據(ju)采(cai)集(ji)‌

　　基(ji)線範圍設為(wei)3-15循(xun)環，閾(yu)值(zhi)設為(wei)指(zhi)數期熒光(guang)信號(hao)10倍(bei)標(biao)準差(cha)‌。

　　四(si)、常(chang)見(jian)問題(ti)與解(jie)決(jue)‌

　　問題(ti)‌ ‌可能原(yuan)因(yin)‌ ‌解(jie)決(jue)方(fang)案(an)‌

　　擴(kuo)增(zeng)曲線斷(duan)裂(lie) 氣(qi)泡幹擾(rao)或模板濃(nong)度過(guo)高 瞬(shun)離(li)去(qu)除氣泡，稀(xi)釋模(mo)板‌

　　無擴(kuo)增(zeng)信號(hao) 引(yin)物降解(jie)或反應條(tiao)件不匹(pi)配(pei) 重新設計引物，優(you)化(hua)退火溫(wen)度‌

　　熔(rong)解(jie)曲(qu)線多峰(feng) 引(yin)物二聚(ju)體或非特(te)異擴(kuo)增(zeng) 重新(xin)設計引物或提高退火溫(wen)度‌

　　註：不(bu)同品牌(pai)試(shi)劑(ji)盒(he)參(can)數可能差(cha)異(yi)較大，建議以實(shi)際(ji)說明書(shu)為準‌。

　　註：僅(jin)供(gong)科(ke)研使用，以上(shang)資料供(gong)參(can)考，如需具(ju)體產品說明請咨(zi)詢(xun)技(ji)術(shu)老師或品牌(pai)供(gong)應(ying)商(shang)。

　　熒光(guang)定(ding)量PCR試(shi)劑(ji)盒(he) 天(tian)津本(ben)生(sheng)壹直(zhi)視質(zhi)量控制為企(qi)業(ye)的生(sheng)命(ming)，追(zhui)求(qiu)企(qi)業(ye)競爭力(li)的(de)不(bu)斷(duan)提(ti)升(sheng)。公司(si)在(zai)經營(ying)中(zhong)始終(zhong)秉(bing)承：遵(zun)紀(ji)守法，嚴於律(lv)己，寬仁(ren)以待，敢(gan)於承(cheng)擔(dan)的企(qi)業(ye)精(jing)神(shen)作(zuo)為(wei)標(biao)準，以過(guo)硬(ying)的質(zhi)量和優(you)良的服務(wu)來維護(hu)和拓展(zhan)市場(chang)，較大限度的(de)滿(man)足(zu)客戶(hu)的需求(qiu)。與客(ke)戶(hu)的共(gong)贏，是我們的(de)發(fa)展(zhan)目標(biao)，本(ben)生(sheng)，您信任的(de)合作(zuo)夥(huo)伴!本(ben)生(sheng)試(shi)劑(ji)盒(he)