問(wen)題(ti)解(jie)析(xi)：熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang)PCR反應結束(shu)無(wu)擴(kuo)增曲線(xian)

　　熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang) PCR反應結束(shu)無(wu)擴(kuo)增曲線(xian)出現(xian)這個問(wen)題(ti)的常(chang)見原因(yin)，主要可以(yi)歸結(jie)為(wei)以(yi)下(xia)幾(ji)種：

　　反應循環數不(bu)夠：壹(yi)般(ban)建(jian)議(yi)設置(zhi)循環數為(wei) 40。

　　程序(xu)中(zhong)未設置(zhi)信號(hao)采集(ji)步驟：註意，兩步(bu)法(fa)擴(kuo)增程序壹(yi)般(ban)將(jiang)信號(hao)采集(ji)設置(zhi)在退(tui)火(huo)延(yan)伸階段(duan);三(san)步(bu)法(fa)擴(kuo)增程序應當將信號(hao)采集(ji)設置(zhi)在 72 度(du)延(yan)伸階段(duan)。

　　引(yin)物降(jiang)解(jie)：長(chang)時(shi)間(jian)未使用(yong)的(de)引(yin)物應先通過 PAGE 電(dian)泳檢(jian)測完整(zheng)性(xing)，以(yi)排除(chu)引物降(jiang)解(jie)的(de)可能(neng)性(xing)。

　　模板濃(nong)度(du)太低(di)：這(zhe)個大(da)家(jia)減少(shao)稀釋度(du)重(zhong)復實(shi)驗(yan)就可以(yi)了，壹(yi)般(ban)來(lai)說(shuo)，未知濃(nong)度(du)的樣品先從最(zui)高濃(nong)度(du)做起。

　　模板降(jiang)解(jie)：無(wu)解(jie)，請重(zhong)新制(zhi)備(bei)模板，可(ke)以(yi)重復(fu)實(shi)驗(yan)。

　　溶(rong)解(jie)曲(qu)線(xian)形狀(zhuang)異(yi)常(chang)

　　(1)雜(za)峰在(zai)主峰(feng)之前(qian)，Tm 約為 70 - 75℃——壹(yi)般(ban)為(wei)引(yin)物二(er)聚(ju)體(ti)

　　這(zhe)種(zhong)情(qing)況(kuang)主要有(you)三(san)個解(jie)決(jue)方法(fa)：

　　重新設計(ji)引物;

　　雜(za)峰為(wei)引物二(er)聚(ju)體(ti)，熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang) PCR引物二(er)聚(ju)體(ti)主(zhu)要是(shi)由(you)於體(ti)系(xi)內(nei)引物與(yu)引物糾纏(chan)比引物與(yu)模板結(jie)合更(geng)容(rong)易(yi)導致的，可以(yi)嘗試提高模板濃(nong)度(du)、退火(huo)溫(wen)度(du)或(huo)者降(jiang)低(di)引(yin)物濃(nong)度(du)來進行改善;

　　另(ling)外，當目(mu)的(de)基(ji)因(yin)表達量(liang)極低(di)時(shi)，染料(liao)法(fa)容易形(xing)成(cheng)引物二(er)聚(ju)體(ti)產物影響(xiang)實(shi)驗(yan)結果(guo)，此(ci)時(shi)，建(jian)議(yi)使用探針(zhen)法(fa)定量(liang)。

　　(2)雜峰(feng)在(zai)主(zhu)峰之後，非引物二(er)聚(ju)體(ti)

　　上(shang)圖(tu)這(zhe)種(zhong)情(qing)況(kuang)就是(shi)非特異性(xing)擴(kuo)增，可能是(shi)引物特(te)異性(xing)不好(hao)引(yin)起的(de)，也可能是(shi)空(kong)氣(qi)中(zhong)有(you)氣(qi)溶(rong)膠(jiao)汙染所導致。

　　大(da)家(jia)可以(yi)先增加退火溫度再(zai)試(shi)試(shi)看，如(ru)果(guo)沒有(you)改善，那(na)麽(me)就需(xu)要重新更(geng)換(huan)引(yin)物啦(la)。

　　為了(le)避免(mian)這種(zhong)麻(ma)煩，BUNSEN本(ben)生小編建(jian)議(yi)大(da)家(jia)在進行熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang) PCR實(shi)驗(yan)之前(qian)，就對自(zi)己(ji)的(de)引(yin)物做(zuo)壹(yi)個特(te)異性(xing)驗證(zheng)。另外(wai)，每次(ci)試(shi)驗的 NTC(no template control)是(shi)壹(yi)定(ding)要做的。

　　(3)只有(you)引(yin)物二(er)聚(ju)體(ti)，無(wu)目(mu)的(de)條(tiao)帶(dai)

　　如果(guo)擴(kuo)增片段過短(小於 80bp)，那(na)麽(me)僅(jin)通過融(rong)解(jie)曲(qu)線(xian)就很難(nan)區分(fen)引(yin)物二(er)聚(ju)/目(mu)的(de)條(tiao)帶(dai)。

　　另外(wai)，也有(you)可(ke)能是(shi) 熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang) PCR 擴(kuo)增效率低(di)或(huo)者沒有(you)擴(kuo)增，體(ti)系(xi)裏(li)邊(bian)只有(you)引(yin)物糾纏(chan)成的(de)二(er)聚(ju)體(ti)了(le)。

　　總(zong)之，產物長(chang)度建(jian)議(yi)大(da)家(jia)還是(shi)設置(zhi)在 100 - 200 bp，不(bu)要太短了。

　　註(zhu)：以(yi)上資(zi)料(liao)僅(jin)供(gong)參(can)考!

　　熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang)PCR 本生(sheng)壹(yi)直(zhi)視(shi)質(zhi)量(liang)控制(zhi)為(wei)企(qi)業(ye)的生(sheng)命(ming)，追求企(qi)業(ye)競(jing)爭力(li)的(de)不(bu)斷(duan)提升(sheng)。公司(si)在(zai)經(jing)營(ying)中始終秉(bing)承(cheng)：遵紀(ji)守法，嚴(yan)於律(lv)己(ji)，寬(kuan)仁(ren)以(yi)待，敢(gan)於承(cheng)擔的(de)企(qi)業(ye)精神(shen)作(zuo)為(wei)標(biao)準，以(yi)過硬(ying)的質(zhi)量(liang)和優良的(de)服(fu)務(wu)來(lai)維護和拓(tuo)展(zhan)市場(chang)，較(jiao)大(da)限度(du)的滿(man)足客戶(hu)的(de)需(xu)求(qiu)。與(yu)客戶(hu)的共贏(ying)，是(shi)我(wo)們(men)的(de)發(fa)展(zhan)目(mu)標(biao)。本(ben)生!您(nin)信任(ren)的合作(zuo)夥(huo)伴。我(wo)們(men)願(yuan)與(yu)您(nin)真(zhen)誠合作(zuo)，共(gong)創(chuang)美(mei)好(hao)的(de)未來。