本生帶您(nin)了(le)解(jie)：ELISA實(shi)驗中(zhong)常見(jian)問題和註意事(shi)項(xiang)
 

　　用(yong)於ELISA測定的臨(lin)床標本最為常用的(de)是(shi)血清(qing)(漿(jiang))。本實(shi)驗室(shi)用(yong)ELISA測定(ding)乙肝兩(liang)對半，甲(jia)肝，戊肝，抗(kang)HIV的(de)標本時(shi)，在處(chu)理和保(bao)存(cun)方(fang)面(mian)要(yao)考(kao)慮以(yi)下幾(ji)個(ge)方面(mian)：

　　1)要(yao)註意(yi)避(bi)免出現(xian)嚴(yan)重溶(rong)血及血清(qing)中(zhong)混有紅細胞。當標本出現(xian)嚴(yan)重溶(rong)血及血清(qing)中(zhong)混有紅細胞時(shi)，反(fan)應孔不易洗凈(jing)，殘留(liu)在反應(ying)孔內的(de)血紅蛋白(bai)具(ju)有過(guo)氧化(hua)物(wu)酶的活(huo)性，顯色時(shi)可(ke)能(neng)造成(cheng)假(jia)陽性。

　　2)標本凝(ning)固不全(quan)強(qiang)行(xing)離(li)心(xin)，造成(cheng)血清(qing)中(zhong)含有少量的纖維(wei)蛋(dan)白(bai)原(yuan)，在實(shi)驗過(guo)程中形成(cheng)纖維(wei)蛋(dan)白(bai)吸(xi)附在反應(ying)孔孔壁上(shang)不易洗掉，易造成(cheng)假(jia)性結(jie)果。

　　3)血清(qing)標本可(ke)在2～8℃下保(bao)存(cun)1周(zhou)。如(ru)血清(qing)樣(yang)本需長時(shi)間(jian)保存(cun)，則(ze)需放(fang)入(ru)-20℃冰櫃(gui)內冰(bing)凍保(bao)存(cun)。冰(bing)凍保(bao)存(cun)的(de)血清(qing)標本須(xu)註(zhu)意避(bi)免反復凍融(rong)，標本可(ke)能(neng)引(yin)起假(jia)陰性結(jie)果。此(ci)外凍融(rong)標本的混勻(yun)不要(yao)進行(xing)劇(ju)烈振(zhen)蕩(dang)，應反(fan)復(fu)顛倒(dao)混勻(yun)。

　　ELISA測定(ding)中試(shi)劑準備：

　　在實(shi)驗開始(shi)前(qian)，將試(shi)劑盒先(xian)從(cong)冰箱中拿(na)出來，在室溫下放(fang)置(zhi)20分(fen)鐘以上後，再進行(xing)測定(ding)，證試(shi)劑盒溫度(du)要(yao)和室(shi)溫壹(yi)致。如(ru)果把試(shi)劑盒從(cong)冰箱拿(na)出來直(zhi)接(jie)做實(shi)驗會(hui)造成(cheng)壹(yi)些(xie)弱陽性標本的檢測(ce)出(chu)現(xian)假(jia)陰性。因(yin)為在後面(mian)的孵(fu)育反應步驟(zhou)中(zhong)，造成(cheng)孵(fu)育時(shi)間(jian)不夠。其次(ci)，ELISA實(shi)驗中(zhong)洗板(ban)用的(de)洗液(ye)需每(mei)日更(geng)換(huan)配(pei)制，稀釋時(shi)所用(yong)的(de)蒸(zheng)餾水(shui)或去(qu)離(li)子(zi)水(shui)應(ying)保(bao)證質(zhi)量。

　　加(jia)血清(qing)樣(yang)本及反應試(shi)劑：

　　血清(qing)樣(yang)本使用微量加(jia)樣(yang)槍加樣(yang)。使用微量加(jia)樣(yang)槍加樣(yang)必(bi)須(xu)註(zhu)意避(bi)免以下幾(ji)點(dian)：

　　1)加(jia)樣太快(kuai)，無(wu)法保(bao)證微量加樣(yang)的(de)準確性和(he)均壹性。需(xu)勻(yun)速加(jia)樣，吸(xi)樣時(shi)，加(jia)樣槍需按(an)到(dao)第壹檔，加樣時(shi)，加(jia)樣槍需直(zhi)接(jie)按到底(di)。

　　2)加(jia)樣(yang)應(ying)直接(jie)加入(ru)反應孔底(di)部，加在反應(ying)孔孔壁上(shang)易濺出會(hui)對鄰(lin)近(jin)孔產生汙染(ran)。盡(jin)量避(bi)免出現(xian)氣(qi)泡(pao)。

　　3)反應(ying)試(shi)劑的加(jia)入(ru)時(shi)先(xian)要(yao)註意(yi)試(shi)劑的有效期，再註(zhu)意(yi)滴加的(de)角(jiao)度和(he)滴(di)加(jia)的速度(du)。滴加(jia)太(tai)快(kuai)易出現(xian)重復滴加或加(jia)在兩(liang)孔之間(jian)。

　　溫育的時(shi)間(jian)與溫度(du)：

　　溫育是ELISA測定(ding)中最(zui)容易出現(xian)問(wen)題的步驟(zhou)。溫育溫度(du)應在37℃，水浴(yu)。溫育時(shi)間(jian)應按照試(shi)劑說明書(shu)上的(de)時(shi)間(jian)嚴格執(zhi)行(xing)。溫育實(shi)際(ji)測(ce)定操作中(zhong)要(yao)註意(yi)以(yi)下幾(ji)點(dian)：

　　1)要(yao)保證在設(she)定的(de)溫度(du)下有足夠的反(fan)應(ying)時(shi)間(jian)。溫育時(shi)間(jian)不夠，弱陽性樣(yang)本測不出(chu)來。

　　2)因(yin)為(wei)采用(yong)水(shui)浴，所以(yi)在溫育時(shi)壹(yi)定要(yao)封板(ban)，防(fang)止水蒸(zheng)氣(qi)形成(cheng)水(shui)滴掉入(ru)反應孔內造成(cheng)汙(wu)染，並有可(ke)能(neng)整板花(hua)板。

　　ELISA測(ce)定的(de)洗板(ban)：

　　全自(zi)動(dong)洗板(ban)機的使用應註意(yi)以(yi)下幾(ji)點(dian)：

　　1)洗板(ban)前(qian)，應檢查(zha)洗液(ye)瓶、蒸(zheng)餾水(shui)瓶是(shi)否充(chong)足，廢液(ye)瓶是(shi)否滿(man)瓶(ping)

　　2)在自檢過(guo)程中註(zhu)意觀察(cha)洗液(ye)灌(guan)註是否(fou)通(tong)暢(chang)，排(pai)液(ye)是否(fou)通暢(chang)。

　　3)在洗板(ban)過(guo)程中，應(ying)註意(yi)觀察(cha)反應(ying)孔每孔是否(fou)灌(guan)滿且(qie)無(wu)外溢，每(mei)孔吸水(shui)是(shi)否(fou)吸盡(jin)，並且(qie)要(yao)保證洗液(ye)在孔中放(fang)置(zhi)的(de)時(shi)間(jian)。

　　BUNSEN本生提醒：ELISA測定(ding)以(yi)TMB為底(di)物(wu)的(de)顯色

　　加入(ru)底(di)物(wu)開始(shi)顯色反應前(qian)，最好是先(xian)檢查(zha)壹下底(di)物(wu)溶(rong)液(ye)的有效期。滴入(ru)A、B顯色劑後，需溫育15min，最後加入(ru)終(zhong)止液(ye)終(zhong)止反應(ying)，振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)後即可(ke)進行(xing)下面(mian)的比色測(ce)定(ding)判斷結(jie)果。在此(ci)過(guo)程中應(ying)註意(yi)不要(yao)把顯色劑和終(zhong)止液(ye)滴入(ru)順(shun)序(xu)弄(nong)反，否(fou)則(ze)重做實(shi)驗。

　　ELISA的(de)比色測(ce)定(ding)

　　ELISA的比色測(ce)定(ding)由酶標儀(yi)進行(xing)測定(ding)，故(gu)需強(qiang)調比色測(ce)定(ding)時(shi)，壹(yi)定要(yao)註意(yi)酶(mei)標儀(yi)的(de)波(bo)長是否是(shi)雙波(bo)長(450nm和630nm)。

　　ELISA測定(ding)結(jie)果判定

　　結(jie)果判定壹(yi)般(ban)是根(gen)據(ju)比色結(jie)果和肉眼(yan)觀察(cha)綜合判定。如(ru)在判定過(guo)程發現(xian)有些(xie)反應(ying)孔出現(xian)倒(dao)陰(yin)不陽的現(xian)象(xiang)或出(chu)現(xian)不常見(jian)的模(mo)式(shi)(如(ru)乙肝兩(liang)對半中(zhong)出(chu)現(xian)12陽性等(deng))，需本著(zhe)嚴(yan)謹的態度(du)，重新復查(zha)。

　　對ELISA測定中出現(xian)問(wen)題的可(ke)能(neng)原(yuan)因(yin)(非(fei)試(shi)劑盒本身的原(yuan)因)，總(zong)結(jie)如(ru)下：

　　1)弱(ruo)陽性質(zhi)控樣(yang)本檢測(ce)不出(chu)溫育的時(shi)間(jian)或溫度(du)不夠;顯色反應時(shi)間(jian)太短;所用(yong)配(pei)制緩(huan)沖液(ye)的蒸(zheng)餾水(shui)有問題。

　　2)測定的重復性差(cha)，這是由(you)於測定操作(zuo)引(yin)起的(de)問(wen)題，包括(kuo)

　　①加樣(yang)本及試(shi)劑量不準;孔間不壹(yi)致(zhi)

　　②加樣(yang)過(guo)快(kuai)，孔間發(fa)生汙染(ran)

　　③加(jia)錯(cuo)樣本

　　④加樣本及試(shi)劑時(shi)，加(jia)在孔壁

　　⑤不同(tong)批號(hao)試(shi)劑盒中(zhong)組(zu)分(fen)混用

　　⑥溫育時(shi)間(jian)、洗板(ban)、顯色時(shi)間(jian)不壹(yi)致(zhi)

　　⑦孔內汙(wu)染雜(za)物，

　　血清(qing)標本未凝(ning)固即(ji)加入(ru)，反應孔內出(chu)現(xian)纖維(wei)蛋(dan)白(bai)凝(ning)固或殘留(liu)血細胞，易出現(xian)假(jia)陽性等(deng)。

　　3)全部孔都不顯色

　　①漏加酶(mei)結(jie)合物;

　　②洗板(ban)液(ye)配制(zhi)中出(chu)現(xian)問(wen)題

　　③漏加顯色劑A或B

　　④終(zhong)止劑當顯色劑使用

　　4)全部板孔均有顯色

　　①板不幹凈(jing)

　　②顯色液(ye)變質(zhi)

　　③洗板(ban)液(ye)受酶(mei)等汙(wu)染(ran)

　　ELISA試(shi)劑盒 本生壹直(zhi)視(shi)質(zhi)量控(kong)制為企(qi)業(ye)的生命，追求(qiu)企(qi)業(ye)競(jing)爭(zheng)力(li)的不斷提升(sheng)。公(gong)司在經營(ying)中(zhong)始終(zhong)秉承(cheng)：遵(zun)紀守法，嚴(yan)於律己(ji)，寬(kuan)仁(ren)以待(dai)，敢於承(cheng)擔的企(qi)業(ye)精(jing)神(shen)作(zuo)為(wei)標準，以過(guo)硬的(de)質(zhi)量和(he)優(you)良的(de)服(fu)務來維(wei)護(hu)和(he)拓(tuo)展市場，較(jiao)大(da)限度(du)的滿足客(ke)戶(hu)的(de)需(xu)求(qiu)。與(yu)客(ke)戶(hu)的(de)共贏(ying)，是我們的(de)發展(zhan)目標。本生!您(nin)信(xin)任的(de)合作夥伴(ban)。我們願(yuan)與您(nin)真(zhen)誠(cheng)合作(zuo)，共創(chuang)美好的未來。