BUNSEN本(ben)生(sheng)分享(xiang)：PCR儀(yi)的(de)原理、分類、常見(jian)問題(ti)

　　壹、PCR的(de)基(ji)本(ben)原理

　　聚合(he)酶鏈(lian)反(fan)應(ying)(polymerasechainreaction，PCR)PCR反(fan)應(ying)過程(cheng)與細胞內(nei)的(de)DNA復制相(xiang)似，但(dan)PCR的(de)反(fan)應(ying)體系(xi)要(yao)簡單的(de)多(duo)，主要(yao)包(bao)括DNA靶序列(lie)、引(yin)物(wu)、4種(zhong)單核苷(gan)酸dNTP、耐(nai)熱(re)DNA聚合(he)酶以(yi)及合適(shi)的(de)緩(huan)沖(chong)液(ye)體系(xi)。

　　PCR反(fan)應(ying)過程(cheng)有(you)以(yi)下3個(ge)步驟(zhou)：

　　1、變(bian)性

　　將(jiang)反(fan)應(ying)體系(xi)混(hun)合物(wu)加(jia)熱到(dao)94℃，維持較短時(shi)間(jian)(大(da)約(yue)15s-30s)，使目標(biao)DNA雙螺(luo)旋(xuan)的(de)氫鍵斷(duan)裂(lie)，形成(cheng)單鏈DNA作(zuo)為反(fan)應(ying)模板。

　　2、退火

　　將(jiang)反(fan)應(ying)體系(xi)冷(leng)卻至(zhi)特定(ding)的(de)溫度(引(yin)物(wu)的(de)TM值左右或以下)，引(yin)物(wu)與(yu)DNA模板的(de)互補(bu)區結(jie)合(he)，形成(cheng)模板(ban)引(yin)物(wu)復(fu)合物(wu)。

　　3、延(yan)伸

　　將(jiang)反(fan)應(ying)體系(xi)的(de)溫度提(ti)高到72℃並(bing)維持壹段時(shi)間(jian)，引(yin)物(wu)在(zai)耐熱聚合酶的(de)作用下，以(yi)引(yin)物(wu)為(wei)固(gu)定起(qi)點(dian)，以(yi)4種(zhong)單核苷(gan)酸(dNTP)作(zuo)為(wei)底(di)物(wu)合(he)成(cheng)新的(de)DNA鏈。

　　以上(shang)三(san)步作(zuo)為(wei)壹個(ge)循環(huan)重(zhong)復(fu)的(de)進行，每壹循環(huan)的(de)產物(wu)作(zuo)為下壹循環(huan)的(de)模板。如此(ci)循環(huan)數十(shi)次，從而(er)使目的(de)基(ji)因(yin)得到指數(shu)級(ji)擴增(zeng)，達到(dao)檢(jian)測或獲取基(ji)因(yin)的(de)目的(de)。

　　二(er)、PCR儀(yi)的(de)分類

　　根(gen)據(ju)DNA擴增(zeng)的(de)目的(de)和檢測(ce)的(de)標準可(ke)以將(jiang)PCR儀(yi)分為(wei)：普(pu)通(tong)PCR儀(yi)，梯(ti)度PCR儀(yi)，原位PCR，實時(shi)熒光定(ding)量(liang)PCR儀(yi)等幾類。

　　2.1普(pu)通(tong)PCR儀(yi)

　　壹般把(ba)壹次PCR擴增(zeng)只能(neng)運(yun)行壹個(ge)特(te)定(ding)退火溫(wen)度的(de)PCR儀(yi)，稱(cheng)之(zhi)為(wei)普(pu)通(tong)PCR儀(yi)。

　　如果(guo)要用它(ta)做不同的(de)退火溫(wen)度則(ze)需(xu)要多(duo)次運(yun)行。主要(yao)是(shi)用作簡單的(de)，對目的(de)基(ji)因(yin)退火溫度的(de)擴增(zeng)。

　　主要(yao)應(ying)用於科研、教學(xue)、臨(lin)床醫(yi)學(xue)、檢(jian)驗、檢疫(yi)等。

　　2.2梯(ti)度PCR儀(yi)

　　壹次性(xing)PCR擴增(zeng)可(ke)以設置(zhi)壹系列(lie)不同的(de)退火溫(wen)度條(tiao)件(通(tong)常12種溫度梯(ti)度)的(de)稱(cheng)之(zhi)為(wei)梯(ti)度PCR儀(yi)。

　　因為(wei)被擴增(zeng)的(de)不同的(de)DNA段其適(shi)合的(de)退火溫(wen)度不同，通(tong)過(guo)設置(zhi)壹系列(lie)的(de)梯(ti)度退(tui)火(huo)溫度進(jin)行擴增(zeng)，從而(er)壹次性(xing)PCR擴增(zeng)就可(ke)以篩(shai)選(xuan)出(chu)表(biao)達量(liang)高的(de)適合退(tui)火(huo)溫(wen)度進(jin)行有(you)效的(de)擴增(zeng)。主要(yao)用(yong)於研究未知DNA退(tui)火溫(wen)度的(de)擴增(zeng)，這樣(yang)既(ji)節約(yue)時(shi)間(jian)，也(ye)節約(yue)經(jing)費(fei)。

　　在(zai)不設置(zhi)梯(ti)度的(de)情況下亦(yi)可(ke)當做普通(tong)的(de)PCR用。真(zhen)正的(de)梯(ti)度，是(shi)每(mei)壹排管(guan)都(dou)有(you)準(zhun)確的(de)加(jia)熱控溫(wen)探頭(tou)。梯(ti)度PCR儀(yi)多(duo)應用於科研、教學(xue)機(ji)構。

　　2.3原位PCR儀(yi)

　　有(you)些(xie)品牌(pai)的(de)PCR儀(yi)具(ju)有(you)普(pu)通(tong)PCR、梯(ti)度PCR、原(yuan)位PCR的(de)功能，通(tong)過(guo)替(ti)換(huan)模(mo)塊進行多(duo)用途開展(zhan)實驗(yan)工(gong)作(zuo)。是用於從細胞內(nei)靶DNA的(de)定位分析(xi)的(de)細胞內(nei)基(ji)因(yin)擴增(zeng)儀(yi)。如病(bing)原基(ji)因(yin)在(zai)細胞的(de)位置(zhi)或目(mu)的(de)基(ji)因(yin)在(zai)細胞內(nei)的(de)作用位置(zhi)等。可(ke)保持(chi)細胞或(huo)組(zu)織的(de)完整性(xing)，使PCR反(fan)應(ying)體系(xi)滲(shen)透到組織和細胞中(zhong)，在(zai)細胞的(de)靶DNA所在(zai)的(de)位置(zhi)進行基(ji)因(yin)擴增(zeng)。

　　不但(dan)可(ke)以檢(jian)測(ce)到(dao)靶DNA，還能標出靶序列(lie)在(zai)細胞內(nei)的(de)位置(zhi)。於分子(zi)和(he)細胞水(shui)平上(shang)研(yan)究疾病的(de)發病機(ji)理和(he)臨(lin)床過(guo)程(cheng)及病(bing)理的(de)轉變(bian)有(you)著(zhe)重(zhong)大(da)的(de)實用(yong)價值(zhi)。

　　2.4實時(shi)熒光定(ding)量(liang)PCR儀(yi)(fluorescencerquantitivepolymerasechainreaction,FQPCR)

　　在(zai)普通(tong)PCR儀(yi)設計(ji)基(ji)礎上(shang)增(zeng)加(jia)熒光信(xin)號激(ji)發和采(cai)集系(xi)統(tong)和(he)計(ji)算(suan)機分析(xi)處(chu)理系(xi)統(tong)，形成(cheng)了具(ju)有(you)熒光定(ding)量(liang)PCR功能(neng)的(de)儀(yi)器(qi)。

　　其(qi)PCR擴增(zeng)原理(li)和(he)普通(tong)PCR擴增(zeng)原理(li)相(xiang)同，在(zai)PCR擴增(zeng)時(shi)加(jia)入(ru)的(de)引(yin)物(wu)是(shi)利(li)用同位素、熒光素(su)等進行標記(ji)，使用引(yin)物(wu)和(he)熒光探針(zhen)同時(shi)與(yu)模(mo)板特異(yi)性(xing)結(jie)合(he)擴增(zeng)。擴增(zeng)的(de)結(jie)果(guo)通(tong)過(guo)熒光信(xin)號采(cai)集系(xi)統(tong)實時(shi)采(cai)集(ji)信號連(lian)接(jie)輸(shu)送到計(ji)算(suan)機分析(xi)處(chu)理系(xi)統(tong)，得(de)出量化(hua)的(de)實時(shi)結(jie)果(guo)輸出。

　　熒光定(ding)量(liang)PCR儀(yi)有(you)單通(tong)道，雙通(tong)道和(he)多(duo)通(tong)道之(zhi)分。當(dang)只用(yong)壹種熒光探針(zhen)標(biao)記(ji)的(de)時(shi)候(hou)，選(xuan)用(yong)單通(tong)道;有(you)多(duo)種熒光標(biao)記(ji)的(de)時(shi)候(hou)使用多(duo)通(tong)道。單通(tong)道也(ye)可(ke)以檢(jian)測(ce)多(duo)熒光的(de)標記和(he)目(mu)的(de)基(ji)因(yin)表(biao)達產(chan)物(wu)，因(yin)為壹次只能(neng)檢測壹種目的(de)基(ji)因(yin)的(de)擴增(zeng)量，需(xu)多(duo)次擴增(zeng)才能(neng)檢(jian)測完不同的(de)目的(de)基(ji)因(yin)片(pian)段的(de)量。多(duo)通(tong)道利(li)於做多(duo)重(zhong)PCR，實現(xian)壹次檢(jian)測(ce)多(duo)種目的(de)基(ji)因(yin)的(de)功能。

　　實時(shi)熒光定(ding)量(liang)PCR儀(yi)主要(yao)應(ying)用於臨床醫(yi)學(xue)檢(jian)測、生(sheng)物(wu)醫(yi)藥研發、食(shi)品行業、科研院校(xiao)等。

　　實時(shi)熒光定(ding)量(liang)PCR儀(yi)+實時(shi)熒光定(ding)量(liang)試劑(ji)+通(tong)用(yong)電(dian)腦(nao)+自動(dong)分析(xi)軟(ruan)件，構成(cheng)PCR-DNA/RNA實時(shi)熒光定(ding)量(liang)檢測(ce)系統(tong)。

　　實時(shi)熒光定(ding)量(liang)PCR的(de)優勢：

　　熒光定(ding)量(liang)PCR儀(yi)比(bi)普通(tong)的(de)PCR儀(yi)多(duo)了熒光信(xin)號采(cai)集系(xi)統(tong)和(he)計(ji)算(suan)機分析(xi)處(chu)理系(xi)統(tong)，實時(shi)熒光定(ding)量(liang)PCR儀(yi)主要(yao)是(shi)用來定量分析(xi)和(he)確定基(ji)因(yin)轉錄水平的(de)，而普通(tong)的(de)PCR儀(yi)是做定性分析(xi)和(he)擴增(zeng)基(ji)因(yin)片(pian)段，定量(liang)PCR儀(yi)可(ke)以做普通(tong)PCR儀(yi)的(de)工(gong)作(zuo)，但(dan)是(shi)成(cheng)本太(tai)高。

　　樣品到達(da)域(yu)值水平所經歷的(de)循環(huan)數稱(cheng)為(wei)Ct值(zhi)(限(xian)制(zhi)點(dian)的(de)循環(huan)數)。域(yu)值應設定在(zai)使指數(shu)期(qi)的(de)擴增(zeng)效率(lv)為(wei)大，這樣可(ke)以獲得準確，可(ke)重(zhong)復(fu)性(xing)的(de)數據(ju)。如果(guo)同時(shi)擴增(zeng)的(de)還有(you)標(biao)有(you)相(xiang)應濃度的(de)標準品，線性回歸分析(xi)將(jiang)產(chan)生(sheng)壹條(tiao)標準(zhun)曲線，可(ke)以用(yong)來(lai)計(ji)算(suan)未知樣(yang)品的(de)濃度。

　　熒光定(ding)量(liang)PCR儀(yi)特點(dian)：

　　1.特(te)異(yi)性(xing)強：引(yin)物(wu)和(he)探針(zhen)的(de)“雙保險"，避(bi)免(mian)檢(jian)測(ce)的(de)假(jia)陽(yang)性(xing)。

　　2.靈敏(min)度高：分析(xi)PCR產(chan)物(wu)的(de)對數期(qi)，自動(dong)化(hua)儀(yi)器(qi)收集熒光信(xin)號，避(bi)免(mian)了(le)許多(duo)人(ren)為因素幹(gan)擾。

　　3.避(bi)免(mian)汙(wu)染：全(quan)封閉反(fan)應(ying)，無須PCR後(hou)處理(li)。

　　4.實現(xian)定(ding)量：運(yun)用標(biao)準品獲得標準曲線，結(jie)合(he)Ct值進行準確定量(liang)。

　　5.高效低耗(hao)：可(ke)實現(xian)壹管(guan)多(duo)檢。

　　6.操作(zuo)簡(jian)便(bian)：在(zai)線式(shi)實時(shi)監測擴增(zeng)結(jie)果(guo)，不必接(jie)觸有(you)害(hai)物(wu)質(zhi)。

　　7.快速(su)：反(fan)應(ying)時(shi)間(jian)<1.5小(xiao)時(shi)。

　　三(san)、PCR常見(jian)問題(ti)匯總(zong)

　　1.無擴增(zeng)條(tiao)帶(dai)

　　(1)酶失(shi)活或(huo)在(zai)反(fan)應(ying)體系(xi)中(zhong)未加(jia)入(ru)酶。TaqDNA聚(ju)合酶因(yin)保存或(huo)運(yun)輸不

　　當(dang)而失(shi)活，往(wang)往(wang)通(tong)過(guo)更(geng)換(huan)新(xin)酶或(huo)用另(ling)壹來源的(de)酶以(yi)獲得滿(man)意(yi)的(de)結(jie)果(guo)。

　　(2)模板含(han)有(you)雜質(zhi)。特(te)別是對(dui)甲(jia)醛固(gu)定及(ji)石蠟包埋(mai)的(de)組織常含甲酸，造(zao)成(cheng)DNA脫(tuo)嘌(piao)呤而(er)影(ying)響PCR的(de)結(jie)果(guo)。

　　(3)變(bian)性溫(wen)度是(shi)否(fou)準確：PCR儀(yi)指示(shi)溫度與(yu)實際溫度是(shi)否(fou)相(xiang)符，過(guo)高酶在(zai)前(qian)幾個(ge)循環(huan)就迅(xun)速失(shi)活;過(guo)低(di)則(ze)模板變(bian)性不*。

　　(4)反(fan)應(ying)系統(tong)中(zhong)汙(wu)染了(le)蛋白(bai)酶及(ji)核酸酶，應(ying)在(zai)未加(jia)Taq酶以(yi)前(qian)，將(jiang)反(fan)應(ying)

　　體系(xi)95℃加(jia)熱5-10分鐘(zhong)。

　　(5)引(yin)物(wu)變(bian)質(zhi)失(shi)效。人(ren)工(gong)合(he)成(cheng)的(de)引(yin)物(wu)是(shi)否正確。是否(fou)純化(hua)，或(huo)因(yin)儲(chu)存(cun)條(tiao)件不當(dang)而失(shi)活。

　　(6)引(yin)物(wu)錯誤(wu)。利(li)用BLAST檢(jian)查引(yin)物(wu)特(te)異(yi)性(xing)或重(zhong)新(xin)設計(ji)引(yin)物(wu)。

　　(7)DNA凝膠(jiao)電(dian)泳(yong)時(shi)加(jia)入(ru)陽(yang)性(xing)對照(zhao)，確保不是(shi)DNA凝膠(jiao)和(he)PCR程(cheng)序的(de)問題(ti)。

　　2.PCR產物(wu)量(liang)過少

　　(1)退(tui)火(huo)溫(wen)度不合(he)適。以2度為(wei)梯(ti)度設計(ji)梯(ti)度PCR反(fan)應(ying)優化(hua)退(tui)火(huo)溫(wen)度。

　　(2)DNA模(mo)板(ban)量太(tai)少。增(zeng)加(jia)DNA模板(ban)量。

　　(3)PCR循環(huan)數不足(zu)。增加(jia)反(fan)應(ying)循環(huan)數。

　　(4)引(yin)物(wu)量(liang)不足(zu)。增加(jia)體系(xi)中(zhong)引(yin)物(wu)含(han)量。

　　(5)延伸時(shi)間(jian)太(tai)短。以(yi)1kb/分鐘(zhong)的(de)原則設置(zhi)延伸時(shi)間(jian)。

　　(6)變(bian)性時(shi)間(jian)過(guo)長。變(bian)性時(shi)間(jian)過(guo)長會(hui)導(dao)致DNA聚合酶失(shi)活。

　　(7)DNA模(mo)板(ban)中(zhong)存(cun)在(zai)抑制劑(ji)。確保DNA模(mo)板幹(gan)凈

　　3.擴增(zeng)產物(wu)在(zai)凝膠(jiao)中(zhong)塗布或(huo)成(cheng)片(pian)狀(zhuang)條(tiao)帶(dai)彌散(san)

　　(1)酶量(liang)過高。減少酶量(liang);酶的(de)質(zhi)量(liang)差，調換(huan)另(ling)壹來源的(de)酶。

　　(2)dNTP濃度過(guo)高。減少dNTP的(de)濃度。

　　(3)MgCl2濃度過(guo)高。可(ke)適當(dang)降(jiang)低(di)其用量(liang)。

　　(4)模板(ban)量(liang)過多(duo)。質(zhi)粒DNA的(de)用量應(ying)<50ng，而(er)基(ji)因(yin)組DNA則應<200ng。

　　(5)引(yin)物(wu)濃度不夠優(you)化(hua)。對(dui)引(yin)物(wu)進(jin)行梯(ti)度稀(xi)釋重(zhong)復(fu)PCR反(fan)應(ying)。

　　(6)循環(huan)次數(shu)過(guo)多(duo);增加(jia)模板(ban)量減少循環(huan)次數(shu)至(zhi)30，縮(suo)短退(tui)火(huo)時(shi)間(jian)及(ji)延伸時(shi)間(jian)，或(huo)改(gai)用二(er)種溫(wen)度的(de)PCR循環(huan)。

　　(7)退火(huo)溫度過(guo)低(di)。

　　(8)電(dian)泳(yong)體系(xi)有(you)問題(ti)：

　　①凝膠(jiao)中(zhong)緩(huan)沖(chong)液(ye)和(he)電(dian)泳(yong)緩(huan)沖(chong)液(ye)濃度相(xiang)差太(tai)大(da);

　　②凝膠(jiao)沒(mei)有(you)凝固(gu)好(hao);

　　③瓊(qiong)脂糖(tang)質(zhi)量(liang)差。

　　(9)若(ruo)為(wei)PCR試劑(ji)盒則(ze)可(ke)能：

　　①由(you)於運(yun)輸儲(chu)存(cun)不當(dang)引(yin)起(qi)試劑(ji)盒失(shi)效;

　　②試劑(ji)盒本(ben)身(shen)質(zhi)量(liang)有(you)問題(ti)，如引(yin)物(wu)選(xuan)擇(ze)、循環(huan)參數(shu)等選(xuan)擇(ze)不當(dang)。

　　(10)降解(jie)的(de)陳舊模(mo)板(ban)擴增(zeng)也(ye)易(yi)產(chan)生(sheng)塗布。

　　4.擴增(zeng)產物(wu)出(chu)現(xian)多(duo)條(tiao)帶(dai)(雜帶(dai))

　　(1)引(yin)物(wu)用(yong)量偏大(da)，引(yin)物(wu)的(de)特異(yi)性(xing)不高。應調換(huan)引(yin)物(wu)或(huo)降低引(yin)物(wu)的(de)使用量(liang)。

　　(2)循環(huan)的(de)次數(shu)過(guo)多(duo)。適當增加(jia)模板(ban)的(de)量，減少循環(huan)次數(shu)。

　　(3)酶的(de)用量偏高或酶的(de)質(zhi)量(liang)不好(hao)，應降(jiang)低酶量(liang)或調換(huan)另(ling)壹來源的(de)酶。

　　(4)退(tui)火溫度偏低(di)，退(tui)火及(ji)延伸時(shi)間(jian)偏長。應提(ti)高退火(huo)溫(wen)度，減(jian)少變(bian)性與(yu)延伸時(shi)間(jian)，也(ye)可(ke)采用(yong)二(er)種溫(wen)度的(de)PCR擴增(zeng)。以2度為(wei)梯(ti)度設計(ji)梯(ti)度PCR反(fan)應(ying)優化(hua)退(tui)火(huo)溫(wen)度。

　　(5)樣(yang)品處理(li)不當(dang)。

　　(6)Mg2+濃度偏高，因適(shi)當(dang)調整Mg2+使用濃度。

　　(7)若(ruo)為(wei)PCR試劑(ji)盒，也(ye)可(ke)能時(shi)試劑(ji)盒本(ben)身(shen)質(zhi)量(liang)有(you)問題(ti)。

　　(8)復制(zhi)提(ti)前(qian)終止(zhi)。使用非(fei)熱(re)啟動(dong)的(de)聚合酶時(shi)常有(you)發生(sheng)。冰(bing)上(shang)準(zhun)備

　　反(fan)應(ying)體系(xi)或(huo)采用(yong)熱啟動(dong)聚(ju)合酶。

　　(9)反(fan)應(ying)緩(huan)沖(chong)液(ye)未*融化(hua)或(huo)未充(chong)分混(hun)勻。確保反(fan)應(ying)緩(huan)沖(chong)液(ye)融(rong)化(hua)完(wan)quan並(bing)*混(hun)勻。

　　(10)引(yin)物(wu)特(te)異(yi)性(xing)差。利(li)用BLAST檢(jian)查引(yin)物(wu)特(te)異(yi)性(xing)或重(zhong)新(xin)設計(ji)引(yin)物(wu)。

　　(11)引(yin)物(wu)量(liang)過多(duo)。減少反(fan)應(ying)體系(xi)中(zhong)引(yin)物(wu)的(de)用量。

　　(12)模(mo)板(ban)量(liang)過多(duo)。質(zhi)粒DNA的(de)用量應(ying)<50ng，而(er)基(ji)因(yin)組DNA則應

　　<200ng。

　　(13)外(wai)源DNA汙(wu)染。確保操作(zuo)的(de)潔凈。

　　5.陰(yin)性(xing)對(dui)照(zhao)出現(xian)條(tiao)帶(dai)

　　試劑(ji)，槍頭(tou)，工(gong)作(zuo)臺汙(wu)染。使用全(quan)新的(de)試劑(ji)和槍頭(tou)，對工(gong)作(zuo)臺進行清

　　潔(jie)。

　　6.條(tiao)帶(dai)大小(xiao)與理(li)論(lun)不符(fu)

　　1)汙(wu)染。使用全(quan)新的(de)試劑(ji)和槍頭(tou)，對工(gong)作(zuo)臺進行清潔(jie)。

　　2)模板(ban)或引(yin)物(wu)使用錯誤(wu)。更(geng)換(huan)引(yin)物(wu)和(he)模板。

　　3)基(ji)因(yin)亞(ya)型。對研(yan)究的(de)基(ji)因(yin)進行序列(lie)分析(xi)和(he)BLAST研究。

　　本生(sheng)壹直視(shi)質(zhi)量(liang)控制(zhi)為(wei)企業(ye)的(de)生(sheng)命(ming)，追求(qiu)企(qi)業競爭(zheng)力(li)的(de)不斷(duan)提(ti)升。公司(si)在(zai)經營中(zhong)始(shi)終(zhong)秉(bing)承(cheng)：遵紀(ji)守(shou)法，嚴(yan)於律己(ji)，寬仁(ren)以(yi)待(dai)，敢於承擔(dan)的(de)企業精(jing)神(shen)作為標準，以(yi)過硬的(de)質(zhi)量(liang)和優良(liang)的(de)服務來(lai)維護和拓(tuo)展(zhan)市(shi)場，較大限(xian)度的(de)滿(man)足(zu)客(ke)戶(hu)的(de)需求。與(yu)客(ke)戶(hu)的(de)共(gong)贏(ying)，是我(wo)們的(de)發展(zhan)目標(biao)。本生(sheng)!您(nin)信(xin)任(ren)的(de)合作夥伴。我(wo)們願(yuan)與(yu)您(nin)真(zhen)誠合(he)作(zuo)，共(gong)創(chuang)美(mei)好(hao)的(de)未來。