免疫(yi)組化(hua)技(ji)術(shu)與Western blotting、ELISA的(de)異(yi)同(tong)、ELISA類型
 

　　1)Western blotting

　　蛋白(bai)質免疫(yi)印(yin)跡，也(ye)是利(li)用抗(kang)體抗原反應(ying)原理，結合(he)化(hua)學發光(guang)等技術來(lai)檢查(zha)組織(zhi)或細(xi)胞(bao)樣(yang)品(pin)內(nei)蛋(dan)白(bai)含(han)量(liang)的(de)檢(jian)測方(fang)法(fa)。與(yu)免疫(yi)組化(hua)技(ji)術(shu)相比(bi)，定量(liang)可能(neng)更加(jia)準(zhun)確(que);當然(ran)Western  blotting也(ye)可定性(xing)和(he)定(ding)位(wei)(通(tong)過提(ti)取膜(mo)蛋(dan)白(bai)或核(he)蛋(dan)白(bai)、胞(bao)漿(jiang)蛋(dan)白(bai)分(fen)別(bie)檢(jian)測其(qi)中(zhong)抗(kang)原含(han)量(liang)，進而(er)間(jian)接反(fan)映它(ta)們(men)的(de)定(ding)位(wei))，但(dan)敏感(gan)性(xing)遠(yuan)遠(yuan)低(di)於(yu)免疫(yi)組化(hua)技(ji)術(shu)。

　　2)ELISA

　　酶聯免疫(yi)吸(xi)附(fu)試驗，也(ye)是利(li)用抗(kang)體-抗原-抗原結合反應(ying)原理來檢(jian)查(zha)體液或組織(zhi)勻(yun)漿(jiang)中(zhong)蛋白(bai)含(han)量(liang)的(de)檢(jian)測。與(yu)免疫(yi)組化(hua)技(ji)術(shu)相比(bi)，定量(liang)準確(que)，是分(fen)泌(mi)性(xing)蛋(dan)白(bai)檢測選(xuan)方(fang)法(fa)之(zhi)壹。

　　(壹)雙抗(kang)體夾心法

　　雙(shuang)抗(kang)體夾心法是檢(jian)測抗(kang)原常用的(de)方(fang)法(fa)，操(cao)作(zuo)步(bu)驟如(ru)下(xia)：

　　(1)將特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體與固相載體連接，形成(cheng)固相抗體：洗(xi)滌(di)除去未(wei)結(jie)合的(de)抗(kang)體及雜(za)質。

　　(2)加(jia)受(shou)檢標(biao)本：使(shi)之(zhi)與固相抗體接觸反應(ying)壹段(duan)時(shi)間(jian)，讓標(biao)本中(zhong)的(de)抗(kang)原與固相載體上的(de)抗(kang)體結合，形成(cheng)固相抗原復合物(wu)。洗(xi)滌(di)除去其(qi)他(ta)未(wei)結(jie)合(he)的(de)物(wu)質(zhi)。

　　(3)加(jia)酶(mei)標抗(kang)體：使固相免疫(yi)復合物(wu)上的(de)抗(kang)原與酶標抗(kang)體結合。洗(xi)滌(di)未(wei)結(jie)合(he)的(de)酶(mei)標(biao)抗體。此時(shi)固相載體上帶(dai)有的(de)酶(mei)量(liang)與標(biao)本中(zhong)受檢(jian)物質的(de)量(liang)正相關。

　　(4)加(jia)底物：夾(jia)心(xin)式復合物(wu)中的(de)酶(mei)催(cui)化底物成(cheng)為有色產物(wu)。根據(ju)顏色反應(ying)的(de)程度進行該(gai)抗原的(de)定(ding)性(xing)或定(ding)量(liang)。

　　根據(ju)同(tong)樣(yang)原理，將大(da)分(fen)子抗原分(fen)別(bie)制(zhi)備(bei)固相抗原和酶標抗(kang)原結合物，即(ji)可用雙(shuang)抗(kang)原夾心法測定(ding)標本中(zhong)的(de)抗(kang)體。

　　(二)雙位(wei)點(dian)壹步(bu)法

　　在(zai)雙(shuang)抗(kang)體夾心法測定(ding)抗原時(shi)，如(ru)應(ying)用針(zhen)對(dui)抗(kang)原分(fen)子上兩(liang)個(ge)不(bu)同(tong)抗原決定簇(cu)的(de)單(dan)克隆抗體分(fen)別(bie)作(zuo)為固相抗體和酶標抗(kang)體，則在(zai)測定(ding)時(shi)可使標(biao)本的(de)加(jia)入(ru)和酶(mei)標抗(kang)體的(de)加(jia)入(ru)兩步(bu)並(bing)作(zuo)壹步(bu)(圖(tu)15-5)。這種(zhong)雙(shuang)位(wei)點(dian)壹步(bu)不但(dan)簡化了(le)操(cao)作(zuo)，縮(suo)短(duan)了(le)反(fan)應(ying)時(shi)間(jian)，如(ru)應(ying)用高親(qin)和(he)力的(de)單(dan)克隆抗體，測定(ding)的(de)敏(min)感(gan)性(xing)和(he)特(te)異(yi)性(xing)也(ye)顯著提高。單克隆抗體的(de)應(ying)用使(shi)測定(ding)抗原的(de)ELISA提(ti)高到新(xin)水(shui)平。

　　在(zai)壹步(bu)法測定(ding)中，應(ying)註(zhu)意(yi)鉤(gou)狀(zhuang)效(xiao)應(ying)(hookeffect)，類同(tong)於(yu)沈澱(dian)反應(ying)中(zhong)抗(kang)原過剩(sheng)的(de)後(hou)帶(dai)現(xian)象。當標(biao)本中(zhong)待(dai)測抗(kang)原濃(nong)度相(xiang)當高時(shi)，過量(liang)抗(kang)原分(fen)別(bie)和(he)固相抗體及酶標(biao)抗體結合，而(er)不(bu)再(zai)形成(cheng)夾心復合物(wu)，所得(de)結果將低(di)於(yu)實際含(han)量(liang)。鉤(gou)狀(zhuang)效(xiao)應(ying)嚴(yan)重(zhong)時(shi)甚至(zhi)可出現(xian)假陰(yin)性(xing)結(jie)果。

　　(三(san))間(jian)接法(fa)測抗(kang)體

　　間(jian)接法(fa)是檢(jian)測抗(kang)體常用的(de)方(fang)法(fa)，其(qi)原理為利用酶(mei)標(biao)記的(de)抗(kang)抗(kang)體以檢測已(yi)與固相結合的(de)受(shou)檢(jian)抗體，故稱(cheng)為間(jian)接法(fa)。操(cao)作(zuo)步(bu)驟如(ru)下(xia)：

　　(1)將特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)原與固相載體連接，形成(cheng)固相抗原：洗(xi)滌(di)除去未(wei)結(jie)合的(de)抗(kang)原及雜(za)質。

　　(2)加(jia)稀(xi)釋的(de)受(shou)檢(jian)血(xue)清：其(qi)中(zhong)的(de)特(te)異(yi)抗體與抗原結合，形成(cheng)固相抗原抗體復合物(wu)。經(jing)洗(xi)滌(di)後(hou)，固相載體上只(zhi)留下(xia)特(te)異(yi)性(xing)抗(kang)體。其(qi)他(ta)免疫(yi)球(qiu)蛋白(bai)及血(xue)清中的(de)雜(za)質由(you)於(yu)不能(neng)與固相抗原結合，在(zai)洗(xi)滌(di)過(guo)程中被(bei)洗(xi)去。

　　(3)加(jia)酶(mei)標抗(kang)抗體：與固相復合物(wu)中的(de)抗(kang)體結合，從而(er)使(shi)該(gai)抗(kang)體間(jian)接地(di)標(biao)記上酶(mei)。洗(xi)滌(di)後(hou)，固相載體上的(de)酶(mei)量(liang)就代表(biao)特異(yi)性(xing)抗(kang)體的(de)量(liang)。例(li)如(ru)欲測人(ren)對某(mou)種(zhong)疾病的(de)抗(kang)體，可用酶(mei)標(biao)羊抗(kang)人(ren)IgG抗體。

　　(4)加(jia)底物顯色：顏色深(shen)度代(dai)表(biao)標本中(zhong)受檢(jian)抗體的(de)量(liang)。

　　本法(fa)只要更(geng)換(huan)不同(tong)的(de)固相抗原，可以用壹種(zhong)酶(mei)標(biao)抗(kang)抗(kang)體檢測各(ge)種(zhong)與(yu)抗(kang)原相應(ying)的(de)抗(kang)體。

　　(四)競爭(zheng)法(fa)

　　競爭(zheng)法(fa)可用於(yu)測定(ding)抗原，也(ye)可用於(yu)測定(ding)抗體。以測定(ding)抗原為例(li)，受檢(jian)抗原和酶標抗(kang)原競爭(zheng)與(yu)固相抗體結合，因(yin)此結合於(yu)固相的(de)酶(mei)標(biao)抗原量與受檢(jian)抗(kang)原的(de)量(liang)呈(cheng)反比(bi)。操(cao)作(zuo)步(bu)驟如(ru)下(xia)：

　　(1)將特(te)異(yi)抗(kang)體與固相載體連接，形成(cheng)固相抗體。洗(xi)滌(di)。

　　(2)待(dai)測管(guan)中加(jia)受(shou)檢標(biao)本和(he)壹定量(liang)酶標(biao)抗原的(de)混(hun)合(he)溶液(ye)，使(shi)之(zhi)與固相抗體反應(ying)。如(ru)受檢(jian)標本中(zhong)無抗(kang)原，則酶標抗(kang)原能(neng)順利(li)地(di)與(yu)固相抗體結合。如(ru)受檢(jian)標本中(zhong)含(han)有(you)抗(kang)原，則與酶標(biao)抗(kang)原以同(tong)樣(yang)的(de)機會(hui)與(yu)固相抗體結合，競爭(zheng)性(xing)地(di)占(zhan)去了(le)酶(mei)標(biao)抗原與固相載體結合的(de)機會(hui)，使(shi)酶標抗(kang)原與固相載體的(de)結(jie)合(he)量減(jian)少(shao)。參(can)考管(guan)中只(zhi)加(jia)酶(mei)標抗(kang)原，保溫(wen)後，酶標(biao)抗原與固相抗體的(de)結(jie)合(he)可達(da)充(chong)分(fen)的(de)量(liang)。洗(xi)滌(di)。  (3)加(jia)底物顯色：參(can)考管(guan)中由(you)於(yu)結合(he)的(de)酶(mei)標(biao)抗原多，故顏色深(shen)。參(can)考管(guan)顏色深(shen)度與(yu)待(dai)測管(guan)顏色深(shen)度之(zhi)差(cha)，代表(biao)受檢(jian)標本抗(kang)原的(de)量(liang)。待(dai)測管(guan)顏色越(yue)淡(dan)，表(biao)示(shi)標(biao)本中(zhong)抗原含(han)量(liang)越(yue)多。

　　(五)捕(bu)獲法測IgM抗(kang)體

　　血(xue)清中針(zhen)對(dui)某(mou)些(xie)抗原的(de)特(te)異(yi)性(xing)IgM常(chang)和(he)特(te)異性(xing)IgG同(tong)時(shi)存在(zai)，後(hou)者(zhe)會幹(gan)擾IgM抗體的(de)測定(ding)。因(yin)此測定(ding)IgM抗本多用捕(bu)獲法，先將所(suo)有(you)血(xue)清IgM(包括異性(xing)IgM和(he)非(fei)特(te)異性(xing)IgM)固定在(zai)固相上，在(zai)去除IgG後(hou)再(zai)測定(ding)特異(yi)性(xing)IgM。操(cao)作(zuo)步(bu)驟如(ru)下(xia)：

　　(1)將抗(kang)人(ren)IgM抗(kang)體連接在(zai)固相載體上，形(xing)成(cheng)固相抗人IgM。洗(xi)滌(di)。

　　(2)加(jia)入(ru)稀(xi)釋的(de)血(xue)清標本：保溫(wen)反應(ying)後(hou)血(xue)清中的(de)IgM抗(kang)體被(bei)固相抗體捕(bu)獲。洗(xi)滌(di)除去其(qi)他(ta)免疫(yi)球(qiu)蛋白(bai)和血(xue)清中的(de)雜(za)質成(cheng)分(fen)。

　　(3)加(jia)入(ru)特異(yi)性(xing)抗(kang)原試劑(ji)：它(ta)只與(yu)固相上的(de)特(te)異(yi)性(xing)IgM結(jie)合(he)。洗(xi)滌(di)。

　　(4)加(jia)入(ru)針(zhen)對(dui)特(te)異(yi)性(xing)的(de)酶(mei)標(biao)抗體：使之(zhi)與結合(he)在(zai)固相上的(de)抗(kang)原反應(ying)結(jie)合(he)。洗(xi)滌(di)。

　　(5)加(jia)底物顯色：如(ru)有顏色顯示(shi)，則(ze)表(biao)示(shi)血(xue)清標本中(zhong)的(de)特(te)異(yi)性(xing)IgM抗(kang)體存在(zai)，是為陽(yang)性(xing)反(fan)應(ying)。

　　(六(liu))應(ying)用親(qin)和(he)素和生物(wu)素(su)的(de)ELISA

　　親(qin)和(he)素是壹種(zhong)糖(tang)蛋(dan)白(bai)，可由(you)蛋清中提(ti)取。分(fen)子量60kD，每個(ge)分(fen)子由(you)4個(ge)亞基組成(cheng)，可以和(he)4個(ge)生物(wu)素(su)分(fen)子親(qin)密(mi)結合。現(xian)在(zai)使(shi)用更(geng)多的(de)是從鏈黴菌中提取的(de)鏈黴和素(strepavidin)。生物(wu)素(su)(biotin)又(you)稱(cheng)維生素(su)H，分(fen)子量244.31，存(cun)在(zai)於(yu)蛋黃中(zhong)。用化(hua)學方(fang)法(fa)制(zhi)成(cheng)的(de)衍生物(wu)，生物(wu)素(su)-羥(qiang)基琥(hu)珀(po)亞胺酯(zhi)(biotin-hydroxysuccinimide，BNHS)可與蛋(dan)白(bai)質、糖(tang)類和酶等多種(zhong)類型的(de)大(da)小(xiao)分(fen)子形成(cheng)生物(wu)素(su)化(hua)的(de)產物(wu)。親(qin)和(he)素與生物(wu)素(su)的(de)結(jie)合(he)，雖(sui)不屬(shu)免疫(yi)反(fan)應(ying)，但(dan)特(te)異(yi)性(xing)強(qiang)，親(qin)和(he)力大(da)，兩者(zhe)壹經(jing)結合(he)就為穩定(ding)。由(you)於(yu)1個(ge)親(qin)和(he)素分(fen)子有4個(ge)生物(wu)素(su)分(fen)子的(de)結(jie)合(he)位(wei)置(zhi)，可以連(lian)接(jie)更多的(de)生物(wu)素(su)化(hua)的(de)分(fen)子，形成(cheng)壹種(zhong)類似(si)晶(jing)格的(de)復合體。因(yin)此把(ba)親(qin)和(he)素和生物(wu)素(su)與(yu)ELIS偶聯起來(lai)，就可大(da)提高ELISA的(de)敏(min)感(gan)度。

　　親(qin)和(he)素-生物(wu)素(su)系統(tong)在(zai)ELISA中(zhong)的(de)應(ying)用有(you)多種(zhong)形(xing)式，可用於(yu)間(jian)接包(bao)被(bei)，亦可用於(yu)終反(fan)應(ying)放大(da)。可以在(zai)固相上先預包(bao)被(bei)親(qin)和(he)素，原用吸(xi)附(fu)法包(bao)被(bei)固相的(de)抗(kang)體或抗(kang)原與生物(wu)素(su)結(jie)合，通(tong)過親(qin)和(he)素-生物(wu)素(su)反(fan)應(ying)而(er)使(shi)生物(wu)素(su)化(hua)的(de)抗(kang)體或抗(kang)在(zai)相(xiang)化(hua)。這種(zhong)包(bao)被(bei)法(fa)不僅(jin)可增加(jia)吸(xi)附(fu)的(de)抗(kang)體或抗(kang)原量，而(er)且(qie)使(shi)其(qi)結(jie)合(he)點(dian)充(chong)分(fen)暴(bao)露(lu)。另外(wai)，在(zai)常(chang)規(gui)ELISA中(zhong)的(de)酶(mei)標(biao)抗體也(ye)可用生物(wu)素(su)化(hua)的(de)抗(kang)體替(ti)代，然(ran)後連接親(qin)和(he)素-酶結合(he)物，以放大(da)反應(ying)信(xin)號(hao)。

　　ELISA試劑(ji)盒(he)  本生壹直(zhi)視(shi)質(zhi)量(liang)控制為企(qi)業的(de)生命，追(zhui)求企(qi)業競爭(zheng)力(li)的(de)不(bu)斷(duan)提升(sheng)。公(gong)司在(zai)經(jing)營中(zhong)始終(zhong)秉承：遵紀(ji)守法，嚴(yan)於(yu)律(lv)己，寬(kuan)仁(ren)以(yi)待(dai)，敢於(yu)承擔的(de)企(qi)業精神作為標準，以過(guo)硬(ying)的(de)質(zhi)量(liang)和優(you)良(liang)的(de)服(fu)務來維(wei)護和拓(tuo)展市場，較大(da)限度的(de)滿(man)足(zu)客(ke)戶的(de)需求。與客(ke)戶的(de)共(gong)贏(ying)，是我(wo)們(men)的(de)發(fa)展目標(biao)。本生!您(nin)信(xin)任的(de)合(he)作(zuo)夥(huo)伴(ban)。我(wo)們(men)願(yuan)與(yu)您真(zhen)誠(cheng)合作(zuo)，共(gong)創(chuang)美(mei)好(hao)的(de)未(wei)來(lai)。