貼壁細胞(bao)培(pei)養(yang)常見(jian)問題(ti)分(fen)析(xi)及(ji)解(jie)決方(fang)法!
 

　　貼壁細胞(bao)在培養時要(yao)貼附於(yu)培(pei)養(yang)(瓶)器皿壁上(shang)，細胞壹(yi)經(jing)貼壁就(jiu)迅速鋪展，然後開(kai)始有(you)絲(si)分(fen)裂，並很(hen)快進(jin)入(ru)對(dui)數(shu)生(sheng)。貼壁細胞(bao)因(yin)其(qi)培養過(guo)程較為(wei)繁(fan)瑣(suo)，所以培養時更(geng)容(rong)易(yi)出現問(wen)題(ti)。BUNSEN本生(sheng)小編(bian)總(zong)結了貼壁細胞(bao)培(pei)養(yang)中常見(jian)問題(ti)，並(bing)詳(xiang)細(xi)介(jie)紹(shao)原因(yin)和(he)解(jie)決方(fang)法，若(ruo)培(pei)養(yang)時遇到(dao)這(zhe)些(xie)情(qing)況(kuang)，可參(can)考(kao)對(dui)應(ying)解(jie)決方(fang)法處(chu)理。

　　壹(yi)、貼壁細胞(bao)培(pei)養(yang)，細胞不貼壁

　　常見(jian)原因(yin)：胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶消化過(guo)度(du);支(zhi)原體汙染(ran);培(pei)養基(ji)pH值過堿(NaHCO3分(fen)解(jie));細(xi)胞老(lao)化(hua);接(jie)種(zhong)細(xi)胞(bao)起(qi)始濃度(du)太(tai)低或(huo)太(tai)高。

　　解(jie)決方(fang)法：縮(suo)短(duan)胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶消化時(shi)間(jian)或(huo)降低胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶濃度(du);分(fen)離(li)培(pei)養(yang)物，檢(jian)測(ce)支(zhi)原體。清潔(jie)支(zhi)架(jia)或(huo)培養(yang)箱。如(ru)發(fa)現支(zhi)原體汙染(ran)，丟棄培養物;使用(yong)無菌(jun)醋(cu)酸溶(rong)液(ye)調整(zheng)pH值或(huo)充入(ru)無菌(jun)CO2;啟(qi)用(yong)新的(de)保種(zhong)細(xi)胞(bao);調節接種(zhong)細(xi)胞(bao)濃度(du)。

　　二、培養(yang)細(xi)胞生(sheng)長(chang)緩慢(man)

　　常見(jian)原因(yin)：由於(yu)更(geng)換不同培養液(ye)或(huo)血清(qing);培養(yang)液(ye)中(zhong)壹(yi)些(xie)細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)必須(xu)成分(fen)如(ru)谷(gu)氨酰(xian)胺(an)或(huo)生(sheng)長(chang)因子耗(hao)盡(jin)或(huo)缺乏(fa)或(huo)已被破壞(huai);培(pei)養物中(zhong)有(you)少(shao)量細(xi)菌(jun)或(huo)真菌(jun)汙染(ran);試(shi)劑保存不當;接(jie)種(zhong)細(xi)胞(bao)起(qi)始濃度(du)太(tai)低;細胞已老(lao)化(hua);支(zhi)原體汙染(ran)。
 

　　解(jie)決方(fang)法：比(bi)較新培(pei)養(yang)液(ye)與(yu)原培(pei)養(yang)液(ye)成分(fen)，比(bi)較新血(xue)清(qing)與(yu)舊(jiu)血(xue)清(qing)支(zhi)持(chi)細胞(bao)生(sheng)長(chang)實(shi)驗，讓細胞(bao)逐(zhu)漸適(shi)應(ying)新(xin)培(pei)養液(ye);換入(ru)新(xin)鮮配(pei)置培養液(ye)，或(huo)補(bu)加谷(gu)氨酰(xian)胺(an)及(ji)生(sheng)長(chang)因子;用(yong)無抗(kang)生(sheng)素培(pei)養(yang)液(ye)培(pei)養，如(ru)發(fa)現汙染(ran)，丟棄培養物;血(xue)清(qing)需(xu)保存在-10到-20℃。培養液(ye)需(xu)在2-8℃避(bi)光保存。含(han)血清(qing)培養液(ye)在2-8℃保存，需(xu)在1周內用(yong)完;增加接種(zhong)細(xi)胞(bao)起(qi)始濃度(du);換用(yong)新的(de)保種(zhong)細(xi)胞(bao);分(fen)離(li)培(pei)養(yang)物，檢(jian)測(ce)支(zhi)原體。清潔(jie)支(zhi)架(jia)和培養(yang)箱。如(ru)發(fa)現支(zhi)原體汙染(ran)，丟棄培養物。

　　三、細胞生(sheng)長(chang)周期變慢(man)，邊(bian)養邊漂(piao)

　　常見(jian)原因(yin)及(ji)解(jie)決方(fang)法：

　　1、細(xi)胞(bao)傳代時(shi)密(mi)度(du)太(tai)稀(xi)或(huo)太(tai)密(mi)：建(jian)議(yi)細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)達80%左(zuo)右(you)進(jin)行(xing)傳代(dai)，傳代(dai)密(mi)度(du)適(shi)中(zhong)，密(mi)度(du)過(guo)低會延長(chang)生(sheng)長(chang)周期;

　　2、傳代(dai)操作不當：根(gen)據細胞特性決定(ding)細胞(bao)消化時(shi)間(jian)，壹(yi)般(ban)在顯微(wei)鏡(jing)下(xia)觀察細(xi)胞回縮(suo)變圓(yuan)並有(you)少(shao)量細(xi)胞(bao)脫落(luo)即(ji)可終止(zhi)消化，難消化的(de)細胞(bao)可分(fen)次消化，每(mei)次時間(jian)不超過(guo)5min;頻繁換液(ye)或(huo)者清(qing)洗細(xi)胞(bao)也會導致細(xi)胞(bao)狀(zhuang)態(tai)變(bian)差(cha)，常規換液(ye)時(shi)間間(jian)隔(ge)為(wei)2~3天(tian)。

　　四、傳(chuan)代(dai)後部分(fen)細(xi)胞(bao)漂(piao)浮

　　常見(jian)原因(yin)及(ji)解(jie)決方(fang)法：

　　1、傳(chuan)代(dai)細胞密(mi)度(du)太(tai)大(da)：壹(yi)般(ban)細胞(bao)匯(hui)合度(du)達到(dao)80%時(shi)可進(jin)行(xing)傳代(dai)操作，傳代(dai)密(mi)度(du)需(xu)適(shi)中(zhong)，傳代密(mi)度(du)過(guo)高也會導致傳(chuan)代(dai)後漂(piao)浮;

　　2、細(xi)胞(bao)狀(zhuang)態(tai)不好：可通過(guo)提高(gao)血清比(bi)例(li)、穩(wen)定(ding)培養(yang)環(huan)境等(deng)方(fang)法進(jin)行(xing)改善(shan);

　　3、吹(chui)打次數(shu)過多造成機械(xie)損(sun)傷(shang)：輕柔吹(chui)打，細(xi)胞呈(cheng)單顆(ke)粒時(shi)可停止(zhi)吹(chui)打，吹(chui)打過(guo)程避(bi)免氣(qi)泡(pao)產生(sheng);

　　4、培養(yang)基更換後不適(shi)應(ying)：更(geng)換回原來的(de)培養(yang)基(ji);或(huo)者與(yu)原培(pei)養(yang)基比(bi)例(li)混(hun)合後使用(yong)，使細胞有(you)個(ge)適(shi)應(ying)期。

　　五、傳代後細胞(bao)全部飄(piao)起(qi)

　　解(jie)決方(fang)法：檢(jian)查所使用(yong)的(de)培養(yang)基(ji)的(de)顏(yan)色(se)是否偏(pian)紫(zi)色(se)，檢(jian)查瓶蓋是否透(tou)氣(qi)，不透氣(qi)瓶蓋是否被擰松(song)。

　　通(tong)常培養基(ji)偏(pian)堿(jian)，顏(yan)色(se)就(jiu)會偏紫，主(zhu)要(yao)是因為(wei)培(pei)養(yang)基裏的(de)酚紅指(zhi)示(shi)劑遇酸(suan)變黃、遇堿(jian)變(bian)紫，培養(yang)基量(liang)太(tai)少(shao)，或(huo)培養(yang)基存放(fang)時間(jian)太(tai)長(chang)時都(dou)會變堿。建(jian)議(yi)配(pei)好培(pei)養(yang)基後分(fen)裝(zhuang)到(dao)50mL離(li)心(xin)管(guan)並於(yu)壹(yi)周內用(yong)完，量(liang)少(shao)時放(fang)到15mL離(li)心(xin)管(guan)裏保(bao)存。

　　六、傳代(dai)後細胞(bao)成團

　　解(jie)決方(fang)法：

　　1、低密(mi)度(du)接(jie)種(zhong)，延長(chang)換液(ye)時(shi)間，防(fang)止(zhi)細(xi)胞(bao)脫落(luo);

　　2、使用(yong)多聚(ju)賴氨酸包(bao)被培養(yang)器皿，以增加細胞(bao)貼壁牢固(gu)度(du)，降低細胞聚集(ji)成團的(de)幾率(lv);

　　3、重新鋪(pu)板，並更(geng)換新(xin)配(pei)制的(de)培養(yang)基(ji)，加大(da)血清(qing)比例(li)(增加比例(li)不超過(guo)5%);

　　4、接(jie)種(zhong)時(shi)，減(jian)少(shao)培養(yang)基(ji)量(liang)(如T25加3mL)以加快細(xi)胞(bao)貼壁速度(du)，等(deng)待細(xi)胞(bao)貼壁後(約8-12小(xiao)時)，再補(bu)加培養(yang)基(ji)到正常用(yong)量。

　　七、傳代(dai)後細胞(bao)變形

　　原因(yin)及(ji)解(jie)決方(fang)法如(ru)下(xia)

　　1)變形，但(dan)細胞還在生(sheng)長(chang)：可能是血清(qing)批(pi)次不壹(yi)樣導(dao)致，血清(qing)成分(fen)復(fu)雜(za)，不同批次和品(pin)牌間均存在成分(fen)差(cha)異，影響(xiang)細胞(bao)狀(zhuang)態(tai)。建(jian)議使用(yong)同壹(yi)批次血清(qing)，更換血(xue)清時(shi)需與(yu)原血(xue)清(qing)比例(li)混(hun)合後使用(yong)，使細胞有(you)過(guo)渡期;

　　2)變形(xing)，但(dan)細(xi)胞(bao)不長(chang)，且(qie)碎片(pian)增多：可能傳代(dai)操作過程(cheng)損(sun)傷(shang)，常見(jian)於(yu)消化不當，或(huo)者潛(qian)在支原體等汙染(ran)導(dao)致細(xi)胞病態(tai);消化時(shi)間(jian)根據每個(ge)細胞(bao)的(de)狀(zhuang)態(tai)來調整(zheng)，消化過(guo)度(du)或(huo)者消化不充分(fen)均會對(dui)細胞(bao)造成影響(xiang);培養(yang)過程(cheng)應(ying)嚴(yan)格(ge)無菌(jun)操作，實(shi)驗環境盡(jin)量潔(jie)凈(jing)，確(que)保(bao)細(xi)胞(bao)無外(wai)源(yuan)汙染(ran)。

　　註(zhu)：僅(jin)供參(can)考(kao)，如(ru)有(you)如(ru)有(you)侵(qin)權或(huo)不願(yuan)小編(bian)轉載(zai)發(fa)布(bu)請聯(lian)系(xi)刪除(chu)，謝謝(xie)!

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