本生(sheng)資(zi)訊：考馬斯(si)藍(lan)染(ran)料(liao)原(yuan)理(li)、使(shi)用(yong)步(bu)驟(zhou)匯(hui)總(zong)

　　考馬斯(si)藍(lan)染(ran)料(liao)簡(jian)介：

　　考馬斯(si)藍(lan)廣(guang)泛(fan)用於(yu)瓊(qiong)脂(zhi)糖或丙(bing)烯酰(xian)胺凝膠(jiao)電泳(yong)分(fen)離(li)蛋白質的可視化(hua)。

　　考馬斯(si)亮藍R250(紅(hong)色染(ran)成藍(lan)色)電(dian)泳(yong)(更靈敏：可以檢(jian)測(ce)到(dao)0.1微克(ke)蛋白質)，考馬斯(si)藍(lan)G250(淺(qian)綠色藍(lan)色)用(yong)於(yu)溶液中的(de)蛋(dan)白質分析(方(fang)便(bian)-可(ke)溶)。兩者(zhe)都(dou)可(ke)以(yi)用於每(mei)種(zhong)應(ying)用(yong)中(zhong)，但是它(ta)們(men)可(ke)以互(hu)換(huan)使(shi)用(yong)，因(yin)為(wei)它們(men)可以(yi)將蛋白質染(ran)色成不同的強(qiang)度和(he)顏色。

　　考馬斯(si)藍(lan)染(ran)料(liao)技術說明(ming)：

　　考馬斯(si)藍(lan)R-250和G-250染(ran)料(liao)是考馬斯(si)染(ran)料(liao)的兩種(zhong)最(zui)常見(jian)的(de)化學形(xing)式，是(shi)二(er)磺化(hua)的三(san)苯基(ji)甲/烷化(hua)合(he)物(wu)。R-250(紅(hong)色)缺(que)少(shao)以G-250(綠色)形(xing)式存(cun)在的(de)兩個(ge)甲基(ji)。“250"最(zui)初表示(shi)染(ran)料(liao)的純度。

　　考馬斯(si)藍(lan)染(ran)色原(yuan)理(li)：

　　不同的顏色是(shi)染(ran)料(liao)分子(zi)不同帶電狀(zhuang)態(tai)的結(jie)果。

　　當pH值小(xiao)於0時，考馬斯(si)藍(lan)G250染(ran)料(liao)會腐蝕所有(you)帶正電荷(he)的(de)三個氮(dan)原(yuan)子(zi)，顏色為(wei)紅(hong)色最(zui)大(da)吸收波長(chang)為(wei)465nm。當pH值約(yue)為(wei)1時，染(ran)料(liao)的總(zong)電荷(he)為(wei)+1(2-磺酸(suan)基(ji)團(tuan)帶負電(dian)，因為(wei)它們(men)的pKa極(ji)低(di))，所以(yi)染(ran)料(liao)是綠色的(de)，具(ju)有(you)吸收能力(li)最(zui)大(da)值為(wei)620nm，而(er)pH值高於2時，染(ran)料(liao)為(wei)亮藍色，最(zui)大(da)值為(wei)595nm。在pH值為(wei)7時,二(er)苯/胺部分(fen)帶正電荷(he)，總(zong)電荷(he)為(wei)−1，染(ran)料(liao)消光(guang)系數為(wei)43 000 M−1厘米(mi)−1.

　　染(ran)料(liao)與蛋白質的氨(an)基(ji)和(he)羧基(ji)(非共價)靜電相互(hu)作(zuo)用(yong)，因此(ci)主要(yao)來(lai)自(zi)堿(jian)性氨(an)基(ji)酸(suan)(主要(yao)是精氨(an)酸(suan)、賴(lai)氨(an)酸(suan)、組(zu)氨(an)酸(suan))，以(yi)及(ji)疏(shu)水(shui)性(xing)氨(an)基(ji)酸(suan)(苯丙(bing)氨(an)酸(suan)，酪(lao)氨(an)酸(suan)、色氨(an)酸(suan))。當在(zai)pH=3.0的(de)0.01M檸檬(meng)酸(suan)鹽緩(huan)沖液中溶(rong)解(jie)時，考馬斯(si)的(de)最(zui)大(da)吸收波長(chang)為(wei)555nm;蛋白質-染(ran)料(liao)復(fu)合(he)物(wu)的(de)特(te)征(zheng)是(shi)峰略(lve)寬(kuan)於(yu)遊(you)離(li)染(ran)料(liao)的峰，最(zui)大(da)值為(wei)549nm。

　　考馬斯(si)凝膠(jiao)染(ran)色劑(ji)和(he)布(bu)拉德福(fu)德蛋(dan)白質分析試劑(ji)是(shi)以(yi)25-50%甲醇(chun)中(zhong)的極(ji)酸(suan)性(xing)溶(rong)液配制的。在(zai)酸性(xing)條(tiao)件下，染(ran)料(liao)主要(yao)通過(guo)堿(jian)性氨(an)基(ji)酸(suan)(主要(yao)是精氨(an)酸(suan)、賴(lai)氨(an)酸(suan)和(he)組(zu)氨(an)酸(suan))與(yu)蛋(dan)白質結合(he)，而(er)絡合(he)物(wu)的(de)形(xing)成穩(wen)定(ding)了產生(sheng)藍(lan)色的(de)染(ran)料(liao)的負電(dian)荷陰(yin)離(li)子(zi)形(xing)式。每(mei)個(ge)蛋(dan)白質分子(zi)結合(he)的(de)考馬斯(si)染(ran)色配(pei)體(ti)的數(shu)量(liang)約(yue)為(wei)與蛋(dan)白質上發(fa)現(xian)的正電荷(he)數(shu)成正比。蛋(dan)白質結合(he)導(dao)致染(ran)料(liao)從紅(hong)棕色至(zhi)亮藍色(最(zui)大(da)吸收波長(chang)為(wei)595nm)。

　　考馬斯(si)藍(lan)G-250染(ran)料(liao)的水(shui)溶(rong)性在膠(jiao)體考馬斯(si)染(ran)色方(fang)案(an)中得(de)到了很(hen)好的(de)應(ying)用(yong)。

　　溶(rong)液中蛋(dan)白質測定-布拉德福(fu)德法(fa)

　　1. 著(zhe)色溶(rong)液成分(fen)：5%考馬斯(si)藍(lan)G250

　　2. 著(zhe)色溶(rong)液制備：

　　a.將50mg考馬斯(si)藍(lan)G250溶於(yu)50ml甲醇(chun)中(zhong)

　　b.從步驟(zhou)1開(kai)始(shi)向(xiang)溶液中加(jia)入(ru)100ml 85%H3PO4

　　c.將步驟2的(de)溶液加入(ru)500ml H2O中(zhong)，混(hun)勻

　　d.過(guo)濾(lv)以去(qu)除任(ren)何(he)沈澱物(wu)

　　e.再添加350ml H2O和(he)miw 儲(chu)存(cun)於4°C。

　　3. 分(fen)析流程20-150 µg 蛋白; 200-1500 µg/mL

　　a. 準(zhun)備0.15M NaCl溶液稀(xi)釋(shi)至(zhi)最(zui)終濃(nong)度為(wei)250、，500、750和1500微(wei)克/毫(hao)升(sheng)濃(nong)度。同(tong)時準(zhun)備待測(ce)樣(yang)品稀(xi)釋(shi)液。

　　b. 向(xiang)單獨(du)的試(shi)管(或分光(guang)光(guang)度計(ji)試(shi)管(guan))中(zhong)添加100µL蛋(dan)白至(zhi)以(yi)上濃度(du)NaCl稀(xi)釋(shi)液中。

　　c. 再向(xiang)每個(ge)試管(guan)中添加5.0mL考馬斯(si)藍(lan)，通過(guo)渦流(liu)或(huo)倒置進行混(hun)合(he)。

　　d. 將分光光(guang)度計(ji)調整(zheng)到(dao)595nm的波長(chang)，並(bing)使(shi)用(yong)不含(han)蛋白質的試管進行空白。

　　e. 等待5分鐘，在(zai)595nm波長(chang)下讀取(qu)每個(ge)標(biao)準(zhun)和每個樣品(pin)。

　　f. 繪制標準(zhun)溶液的吸光(guang)度與蛋(dan)白濃度的關系。計(ji)算(suan)消光(guang)系數並(bing)計(ji)算(suan)未(wei)知樣本的濃(nong)度(du)。

　　考馬斯(si)藍(lan)染(ran)料(liao)本生(sheng)壹直(zhi)視(shi)質(zhi)量(liang)控(kong)制為(wei)企(qi)業的(de)生(sheng)命(ming)，追求企(qi)業競(jing)爭(zheng)力(li)的(de)不斷(duan)提升(sheng)。公司在經營中(zhong)始(shi)終(zhong)秉(bing)承：遵紀守法(fa)，嚴(yan)於律(lv)己，寬(kuan)仁(ren)以(yi)待(dai)，敢於承(cheng)擔的企(qi)業精神作為(wei)標準(zhun)，以過(guo)硬(ying)的質量(liang)和(he)優良(liang)的服務來(lai)維(wei)護(hu)和拓(tuo)展市場(chang)，較大(da)限(xian)度(du)的滿足(zu)客戶(hu)的(de)需求(qiu)。與客戶(hu)的(de)共贏，是我(wo)們(men)的發(fa)展目標(biao)。本生(sheng)!您信(xin)任(ren)的(de)合(he)作(zuo)夥伴。我(wo)們(men)願與(yu)您真誠合(he)作(zuo)，共創(chuang)美好的未來(lai)。