ELISA實(shi)驗要(yao)點(dian)：實驗(yan)結果(guo)不(bu)理想不(bu)容(rong)忽視的(de)幾(ji)點(dian)
 

　　優化ELISA的(de)重(zhong)點(dian)之(zhi)壹在(zai)於洗(xi)滌(di)。洗(xi)滌(di)步驟可降低(di)未(wei)結(jie)合(he)抗體(ti)所(suo)引起(qi)的(de)背(bei)景信(xin)號，從而增(zeng)加(jia)分析(xi)的(de)信(xin)噪(zao)比。每壹步(bu)之(zhi)間(jian)的(de)洗(xi)滌(di)確(que)保(bao)只有特(te)異(yi)的(de)結(jie)合(he)事件被保(bao)留(liu)，在(zai)最(zui)後壹步(bu)產(chan)生信(xin)號。而不充分的(de)洗(xi)滌(di)會導(dao)致差(cha)異(yi)和(he)高背(bei)景，從而帶來(lai)不理(li)想(xiang)的(de)結(jie)果(guo)。

　　在(zai)做(zuo)ELISA實(shi)驗(yan)時，洗(xi)板有兩(liang)種(zhong)方法(fa)：手工法(fa)洗(xi)板 和(he) 洗(xi)板機洗(xi)板。二(er)者(zhe)沒(mei)有本質(zhi)的(de)差(cha)別(bie)，只要(yao)操(cao)作合(he)乎要(yao)求，均(jun)能得(de)到(dao)正(zheng)確(que)、可靠(kao)的(de)結(jie)果(guo)。

　　手(shou)工洗(xi)板

　　手(shou)工洗(xi)板人為(wei)因(yin)素比較(jiao)大(da)，實驗(yan)人員必須(xu)經(jing)驗(yan)豐(feng)富，洗(xi)滌(di)次(ci)數(shu)要(yao)足夠，沖擊力(li)又(you)不要(yao)太大(da)，加(jia)入的(de)洗(xi)液量以(yi)說明書(shu)為準，防止(zhi)孔(kong)口(kou)內(nei)有遊(you)離(li)酶未(wei)能洗(xi)凈(jing)，同時防(fang)止(zhi)孔(kong)與孔(kong)之(zhi)間(jian)液體交(jiao)叉(cha)。洗(xi)滌(di)結束(shu)後扣幹(gan)亦(yi)非(fei)常(chang)重要(yao)，否則易造(zao)成假(jia)陽(yang)性。每(mei)次(ci)洗(xi)完(wan)板後(hou)，在(zai)吸水紙上輕輕拍幹(gan)，拍板時要(yao)垂直，避免(mian)交(jiao)叉(cha)感染(ran)。用力(li)不(bu)能過(guo)猛(meng)，防(fang)止抗原抗體(ti)復(fu)合(he)物脫(tuo)離;吸水紙要(yao)壹次(ci)性使(shi)用，應(ying)使(shi)用不易(yi)脫(tuo)落碎(sui)屑的(de)吸水紙為宜。酶結合(he)物不(bu)耐(nai)幹(gan)燥(zao)，特(te)別(bie)在(zai)較(jiao)高的(de)溫(wen)度(du)下更(geng)易(yi)失活(huo)，所(suo)以拍幹(gan)的(de)反應(ying)板應(ying)盡(jin)量縮(suo)短在(zai)空氣中暴露的(de)時間(jian)，時間(jian)越(yue)長(chang)，吸光度值(zhi)越(yue)低(di)。

　　手工操(cao)作有 浸(jin)泡式 和(he) 流水沖洗(xi)式(shi) 兩種方法(fa)：

　　浸(jin)泡式

　　1. 吸幹(gan)或(huo)甩幹(gan)孔(kong)內(nei)反應(ying)液;

　　2. 用洗(xi)滌(di)液過(guo)洗(xi)壹遍(bian)(將(jiang)洗(xi)滌(di)液註(zhu)滿板孔(kong)後，即甩(shuai)去);

　　3. 浸(jin)泡，即將(jiang)洗(xi)滌(di)液註(zhu)滿板孔(kong)，放置(zhi)1～2分鐘(zhong)，間(jian)歇搖動，浸(jin)泡時間(jian)不(bu)可隨(sui)意(yi)縮短;

　　4. 吸幹(gan)孔(kong)內(nei)液體。吸幹(gan)應(ying)，可用水泵(beng)或(huo)真空泵(beng)抽(chou)吸，也(ye)可甩(shuai)去液體後(hou)在(zai)清潔毛(mao)巾(jin)或吸水紙上拍幹(gan);

　　5. 重(zhong)復(fu)操(cao)作步驟3和(he)4，洗(xi)滌(di)3～4次(ci)(或(huo)按(an)說明規(gui)定)。在(zai)間接法(fa)中如(ru)本底較(jiao)高，可增(zeng)加(jia)洗(xi)滌(di)次(ci)數(shu)或延長(chang)浸(jin)泡時間(jian)。

　　微(wei)量滴(di)定板多(duo)采(cai)用浸(jin)泡式洗(xi)滌(di)法(fa)。洗(xi)滌(di)液多為(wei)含(han)非(fei)離(li)子型(xing)洗(xi)滌(di)劑的(de)中(zhong)性緩(huan)沖液。聚苯乙xi載(zai)體與蛋(dan)白質(zhi)的(de)結(jie)合(he)是疏(shu)水性的(de)，非(fei)離(li)子型(xing)洗(xi)滌(di)劑既含(han)疏(shu)水基(ji)團(tuan)，也(ye)含(han)親(qin)水基(ji)團(tuan)，其疏(shu)水基(ji)團(tuan)與蛋(dan)白質(zhi)的(de)疏(shu)水基(ji)團(tuan)借(jie)疏(shu)水鍵(jian)結(jie)合(he)，從而削弱蛋(dan)白質(zhi)與固相(xiang)載(zai)體的(de)結(jie)合(he)，並借(jie)助於(yu)親(qin)水基(ji)團(tuan)和(he)水分子的(de)結(jie)合(he)作用，使(shi)蛋(dan)白質(zhi)回復(fu)到水溶液狀態，從而脫(tuo)離固相(xiang)載(zai)體。

　　洗(xi)滌(di)液中的(de)非(fei)離(li)子型(xing)洗(xi)滌(di)劑壹般是吐(tu)溫20，其濃度(du)可在(zai)0.05%～0.2%之(zhi)間(jian)，高於(yu)0.2%時，可使(shi)包被在(zai)固相(xiang)上(shang)的(de)抗原或抗體(ti)解(jie)吸附(fu)而減低(di)試(shi)驗的(de)靈(ling)敏度(du)。

　　流水沖洗(xi)式(shi)

　　流水沖洗(xi)法(fa)最(zui)初(chu)用於小(xiao)珠(zhu)載(zai)體的(de)洗(xi)滌(di)，洗(xi)滌(di)液僅為(wei)蒸餾(liu)水甚至(zhi)可用自來(lai)水。洗(xi)滌(di)時附(fu)接(jie)壹特(te)殊(shu)裝置，使(shi)小(xiao)珠(zhu)在(zai)流水沖擊下不(bu)斷地(di)滾動淋(lin)洗(xi)，持(chi)續沖洗(xi)2分(fen)鐘後，吸幹(gan)液體，再用蒸餾(liu)水浸(jin)泡2分鐘(zhong)，吸幹(gan)即可。浸(jin)泡式猶(you)如盆浴，流水沖洗(xi)式(shi)則好比淋浴(yu)，其洗(xi)滌(di)效果(guo)更(geng)為，且也(ye)簡(jian)便、快速(su)。

　　已有實(shi)驗(yan)表明(ming)，流水沖洗(xi)式(shi)同樣也(ye)適(shi)用於微(wei)量滴(di)定板的(de)洗(xi)滌(di)。洗(xi)滌(di)時設法(fa)加(jia)大(da)水流量或(huo)加(jia)大(da)水壓(ya)，讓水流沖擊板孔(kong)表面(mian)，洗(xi)滌(di)效果(guo)更(geng)佳。

　　洗(xi)板機洗(xi)板

　　洗(xi)板機洗(xi)板人為(wei)因(yin)素少，速度快(kuai)，條(tiao)件恒定(ding)，但(dan)是使(shi)用洗(xi)板機洗(xi)板時應(ying)註(zhu)意(yi)以下三(san)個(ge)關鍵(jian)點(dian)。

　　洗(xi)滌(di)參數

　　主要(yao)的(de)參(can)數(shu)是(shi)洗(xi)滌(di)量。自(zi)動洗(xi)板機會分配(pei)洗(xi)滌(di)液。如果(guo)妳(ni)之(zhi)前遭遇(yu)過(guo)高背(bei)景，那(na)麽(me)不(bu)要(yao)猶豫，將洗(xi)滌(di)量調(tiao)為高，最(zui)好是(shi)比包被體(ti)積(ji)更(geng)高。太少(shao)的(de)洗(xi)滌(di)液會讓壹部(bu)分(fen)分(fen)析(xi)表面(mian)洗(xi)滌(di)不到，從而明顯增(zeng)加(jia)背(bei)景。所(suo)有反應(ying)孔(kong)的(de)洗(xi)滌(di)量必須(xu)相(xiang)同。

　　天(tian)津(jin)本生ELISA試(shi)劑盒的(de)使(shi)用手冊(ce)中(zhong)有列出洗(xi)滌(di)量。我(wo)們(men)建(jian)議(yi)使(shi)用350µl洗(xi)滌(di)液進行(xing)洗(xi)滌(di)，以便清潔整個(ge)反應(ying)孔(kong)的(de)壁。壹般來(lai)說，洗(xi)滌(di)量越(yue)高，則(ze)孵(fu)育(yu)步驟殘(can)留(liu)的(de)抗體(ti)或(huo)抗原量就(jiu)越(yue)少。

　　洗(xi)滌(di)次(ci)數(shu)

　　影響(xiang)洗(xi)滌(di)效果(guo)的(de)主(zhu)要(yao)參數是洗(xi)滌(di)循(xun)環的(de)量。當然，洗(xi)滌(di)次(ci)數(shu)越(yue)多，背(bei)景越(yue)低(di)。然而，太多(duo)次(ci)的(de)洗(xi)滌(di)會降低(di)信(xin)號強度，使(shi)其(qi)難(nan)以(yi)測定(ding)。通(tong)常(chang)的(de)做(zuo)法(fa)是在(zai)每次(ci)抗體(ti)或(huo)抗原孵育(yu)後重復(fu)洗(xi)滌(di)三(san)次(ci)。不(bu)過(guo)，壹般而言，包被平板需(xu)要(yao)的(de)洗(xi)滌(di)次(ci)數(shu)比用戶包被的(de)平板要(yao)少。對於用戶包被的(de)ELISA板，必須(xu)優化洗(xi)滌(di)次(ci)數(shu)。

　　控制(zhi)洗(xi)滌(di)量和(he)洗(xi)滌(di)次(ci)數(shu)的(de)另壹種(zhong)方法(fa)是加(jia)入過(guo)量的(de)洗(xi)滌(di)液。壹般來(lai)說，96孔(kong)板的(de)每(mei)個(ge)孔(kong)能容(rong)納330至(zhi)460 µl。不(bu)過(guo)，有些自(zi)動化洗(xi)板機可設置(zhi)程(cheng)序，分(fen)配(pei)遠遠超(chao)出(chu)這個(ge)量的(de)洗(xi)滌(di)液，比如1 ml。它(ta)是如(ru)何(he)做(zuo)到(dao)的(de)呢(ne)?其(qi)實(shi)很(hen)簡(jian)單(dan)，就(jiu)是(shi)在(zai)分液的(de)同時打開吸液功(gong)能。換(huan)句(ju)話說，隨(sui)著分液器(qi)分(fen)配(pei)更多的(de)液體，抽(chou)吸器(qi)也(ye)將(jiang)液體吸出(chu)。這種(zhong)技術能增(zeng)加(jia)洗(xi)滌(di)量，但(dan)不會溢出(chu)到其(qi)他(ta)孔(kong)中。

　　抽(chou) 吸

　　還(hai)有壹些參(can)數(shu)會影響(xiang)洗(xi)滌(di)步驟的(de)效(xiao)果(guo)。這些參(can)數(shu)包括(kuo)吸液高度(du)和(he)吸入(ru)位(wei)置，這兩(liang)者(zhe)都能調整，以(yi)降低(di)背(bei)景(殘(can)留(liu)量)和(he)差(cha)異(yi)。

　　殘留(liu)液體中(zhong)包含(han)未(wei)結(jie)合(he)的(de)抗原或抗體(ti)，它(ta)們(men)會增(zeng)加(jia)背(bei)景信(xin)號。殘(can)留(liu)量越(yue)小，殘留(liu)液體越(yue)少，轉移(yi)到下壹步(bu)的(de)幹(gan)擾(rao)液體也(ye)就(jiu)越(yue)少。

　　吸液高度(du)會明顯(xian)影響(xiang)殘(can)留(liu)量;如(ru)果(guo)洗(xi)滌(di)吸頭(tou)與反應(ying)孔(kong)底部(bu)的(de)距(ju)離(li)稍(shao)大(da)，那(na)就會讓殘留(liu)量急劇(ju)增(zeng)加(jia)。反之(zhi)，如(ru)果(guo)洗(xi)滌(di)吸頭(tou)壓(ya)著反應(ying)孔(kong)底部(bu)，那(na)麽(me)也(ye)會使(shi)吸液效率降低(di)，殘留(liu)量增(zeng)加(jia)。

　　目前的(de)洗(xi)板機壹般使(shi)用兩種(zhong)類型(xing)的(de)洗(xi)頭(tou)：剛(gang)性和(he)浮(fu)動。浮(fu)動洗(xi)頭(tou)中的(de)吸頭(tou)可在(zai)洗(xi)滌(di)過(guo)程(cheng)中自(zi)由(you)上(shang)下移(yi)動，而剛(gang)性洗(xi)頭(tou)則固定在(zai)適(shi)當的(de)位(wei)置。使(shi)用剛(gang)性洗(xi)頭(tou)的(de)洗(xi)滌(di)操(cao)作在(zai)優化起(qi)來(lai)更為(wei)復(fu)雜，因(yin)為妳需(xu)要(yao)非常(chang)仔細(xi)地(di)調整(zheng)吸液高度(du)。如(ru)果(guo)妳(ni)們(men)實(shi)驗室使(shi)用幾種(zhong)不(bu)同的(de)板，那(na)可能會很(hen)耗時。在(zai)使(shi)用浮(fu)動洗(xi)頭(tou)時，吸頭(tou)會降到(dao)反應(ying)孔(kong)的(de)底(di)部(bu)。調(tiao)整(zheng)高度(du)就(jiu)不(bu)是很(hen)重(zhong)要(yao)，因此洗(xi)頭(tou)會下降到(dao)底部(bu)。

　　抽(chou)吸的(de)位(wei)置也(ye)對殘留(liu)量有著重要(yao)影響(xiang);如(ru)果(guo)每(mei)個(ge)孔(kong)只使(shi)用壹個(ge)抽吸點(dian)(這很(hen)常(chang)見，因為(wei)更快(kuai))，那(na)麽(me)抽(chou)吸的(de)位(wei)置需(xu)要(yao)優化。z佳的(de)位(wei)置取決於(yu)洗(xi)頭(tou)的(de)性狀(zhuang)，但(dan)它幾(ji)乎(hu)不(bu)在(zai)反應(ying)孔(kong)的(de)中(zhong)間(jian)，即使(shi)這是(shi)所(suo)有洗(xi)頭(tou)z常(chang)見的(de)默(mo)認(ren)位(wei)置。壹般來(lai)說，z佳位(wei)置在(zai)孔(kong)中間(jian)與孔(kong)壁之(zhi)間(jian)的(de)某(mou)處(chu)。

　　反應(ying)孔(kong)的(de)形(xing)狀也(ye)會影響(xiang)殘(can)留(liu)量。C形(xing)底(平底(di)圓(yuan)角(jiao))的(de)微(wei)孔(kong)板壹般會比那(na)些平底(di)尖角(jiao)的(de)微(wei)孔(kong)板殘(can)留(liu)量更(geng)低(di)。

　　洗(xi)板時應(ying)註(zhu)意(yi)

　　1. 需每(mei)天(tian)校正(zheng)註(zhu)液量及(ji)殘液量，洗(xi)滌(di)後殘液量不(bu)得(de)大(da)於2 μl。

　　2. 及(ji)時更(geng)換(huan)破損(sun)吸液針，避(bi)免破(po)壞(huai)底板包被。

　　3. 針(zhen)對不同廠家(jia)酶標板註(zhu)意(yi)調整(zheng)吸液頭下降高度(du)，避(bi)免(mian)沖洗(xi)針(zhen)頭卡(ka)住(zhu)酶標板。

　　4. 註(zhu)意(yi)調整(zheng)洗(xi)液量，洗(xi)液量過(guo)多將(jiang)溢出，過(guo)少將(jiang)達(da)不到洗(xi)滌(di)效果(guo)。

　　5. 關(guan)機前使(shi)用蒸餾(liu)水沖洗(xi)管(guan)道，避(bi)免(mian)洗(xi)液的(de)結(jie)晶(jing)物堵(du)塞(sai)管(guan)道。

　　4. 不(bu)同種試(shi)劑盒的(de)洗(xi)液嚴(yan)禁(jin)混(hun)合(he)使(shi)用。

　　ELISA試(shi)劑盒 本生壹直視質(zhi)量控制(zhi)為企(qi)業的(de)生命，追(zhui)求企業(ye)競爭(zheng)力(li)的(de)不(bu)斷提升(sheng)。公司在(zai)經(jing)營中(zhong)始終秉承(cheng)：遵(zun)紀(ji)守(shou)法(fa)，嚴(yan)於律己，寬仁以(yi)待(dai)，敢(gan)於承(cheng)擔的(de)企(qi)業(ye)精(jing)神(shen)作為標準，以過(guo)硬的(de)質(zhi)量和(he)優良(liang)的(de)服務(wu)來(lai)維(wei)護和(he)拓(tuo)展市(shi)場(chang)，較(jiao)大(da)限度(du)的(de)滿足客戶的(de)需(xu)求。與客戶的(de)共(gong)贏，是(shi)我(wo)們(men)的(de)發(fa)展(zhan)目標。本生!您信(xin)任的(de)合(he)作夥伴。我(wo)們(men)願(yuan)與您(nin)真(zhen)誠(cheng)合(he)作，共(gong)創(chuang)美好的(de)未(wei)來(lai)。