ELISA實驗中常見(jian)的(de)問題(ti)

　　問題(ti)壹:哪(na)些(xie)樣本(ben)可(ke)用於(yu)ELISA實驗?

　　答(da):血清(qing)、血漿(jiang)、細(xi)胞(bao)培養上(shang)清、組(zu)織(zhi)勻(yun)漿(jiang)、細(xi)胞(bao)裂解(jie)液、尿(niao)液、唾液、腦脊液等。不(bu)同(tong)的(de)樣本(ben)類(lei)型有(you)不同(tong)的(de)處(chu)理(li)方(fang)法(fa)。

　　1、血清(qing):指(zhi)血液凝(ning)固(gu)後(hou)，在血漿(jiang)中除去纖(xian)維蛋白(bai)原(yuan)及(ji)某(mou)些(xie)凝(ning)血因子(zi)後(hou)分(fen)離(li)出的(de)淡黃色透(tou)明(ming)液體(ti)或指(zhi)纖(xian)維蛋白(bai)原(yuan)已被除去的(de)血漿(jiang)。血清(qing)是 ELISA 實驗常用的(de)樣本(ben)，其(qi)預處理(li)也十(shi)分(fen)簡(jian)單(dan)。

　　使(shi)用無(wu)熱原(yuan)無(wu)內(nei)毒(du)素的(de)試(shi)管或(huo)離心管采(cai)集血液樣本(ben)，將試(shi)管或(huo)離心管在室(shi)溫(wen)下放(fang)置 2 小(xiao)時或 4℃過(guo)夜(ye)，分(fen)離(li)出血清(qing)(建議(yi)傾(qing)斜(xie)試(shi)管或(huo)離心管以擴(kuo)大(da)液面(mian)的(de)橫(heng)截(jie)面(mian)，使(shi)血清(qing)可(ke)以更(geng)大(da)程(cheng)度(du)地(di)分(fen)離(li)出來)。4℃下(xia)以1000×g 離心 20 分(fen)鐘(zhong)，小(xiao)心收(shou)集上(shang)清液(血清(qing))，立即(ji)進行(xing)測(ce)定(ding)。建議(yi)在-20℃或(huo)-80℃下(xia)將收(shou)集的(de)血清(qing)分(fen)裝保(bao)存(cun)，避(bi)免反(fan)復凍(dong)融(rong)。

　　在收(shou)集血液樣本(ben)的(de)過(guo)程(cheng)中應避(bi)免溶(rong)血，因為紅(hong)細(xi)胞(bao)在溶(rong)解(jie)時(shi)會(hui)釋(shi)放(fang)具(ju)有(you)過(guo)氧(yang)化(hua)物酶活性(xing)的(de)物(wu)質，這(zhe)種(zhong)情(qing)況下(xia)，ELISA 實驗中將會(hui)出現非(fei)特異(yi)性顯色反(fan)應，導致(zhi)檢測結果不準確，出現假(jia)陽(yang)性(xing)結果。另外，樣本(ben)還(hai)應(ying)避(bi)免細(xi)菌(jun)汙(wu)染(ran)，因為細(xi)菌(jun)可(ke)能含(han)有(you)內(nei)源性HRP，也會(hui)導致(zhi)檢測結果不準確。

　　2. 血漿(jiang):是離(li)開血管的(de)全(quan)血經抗凝處(chu)理(li)後(hou)，通(tong)過(guo)離(li)心沈(chen)澱(dian)，所(suo)獲得(de)的(de)不(bu)含(han)細(xi)胞(bao)成分(fen)的(de)液體(ti)。血漿(jiang)與(yu)血清(qing)的(de)主(zhu)要(yao)區別(bie)在於(yu)血漿(jiang)中含(han)有(you)纖(xian)維蛋白(bai)。

　　使(shi)用含(han)抗凝劑(ji)的(de)采(cai)血管或(huo)離心管采(cai)集血液樣本(ben)，采(cai)集(ji)後(hou) 30 分(fen)鐘(zhong)內(nei)，4℃下(xia)以 1000×g離心 15 分(fen)鐘(zhong)，小(xiao)心收(shou)集上(shang)清液(血漿(jiang))。建議(yi)在-20℃或(huo)-80℃下(xia)將收(shou)集的(de)血漿(jiang)分(fen)裝保(bao)存(cun)，避(bi)免反(fan)復凍(dong)融(rong)。樣本(ben)應(ying)避(bi)免溶(rong)血或(huo)高血脂(zhi)。常見(jian)的(de)抗凝劑(ji)包(bao)括 EDTA(部(bu)分(fen)酶相(xiang)關(guan)指(zhi)標不(bu)建議(yi)使用)，肝素(su)鈉，枸(gou)櫞酸(suan)鈉等。檢(jian)測(ce)前請(qing)仔細(xi)閱讀(du) ELISA 試(shi)劑盒說明(ming)書(shu)，查(zha)看(kan)該(gai)試(shi)劑盒針對(dui)抗凝劑(ji)是(shi)否有(you)特殊要(yao)求(qiu)。

　　3. 細(xi)胞(bao)培養上(shang)清:含(han)有(you)細(xi)胞(bao)分(fen)泌(mi)蛋白(bai)和(he)死細(xi)胞(bao)的(de)細(xi)胞(bao)培養液。

　　將細(xi)胞(bao)培養上(shang)清液吸(xi)入離(li)心管中並以 1000×g 離心 20 分(fen)鐘(zhong)，除去細(xi)胞(bao)碎片和(he)雜(za)質，收(shou)集上(shang)清液備用，樣本(ben)保(bao)存(cun)在-20℃或(huo)-80℃，避(bi)免反(fan)復凍(dong)融(rong)。

　　4. 細(xi)胞(bao)裂解(jie)液:經細(xi)胞(bao)裂解(jie)液裂(lie)解(jie)後(hou)的(de)細(xi)胞(bao)溶(rong)液。

　　(1)吸(xi)出培養板中的(de)培(pei)養基，用胰(yi)蛋白(bai)酶消(xiao)化(hua)細(xi)胞(bao)，然後加入適量的(de)培(pei)養基將培養板上(shang)的(de)細(xi)胞(bao)沖洗(xi)幹凈(jing)。 懸浮細(xi)胞(bao)可(ke)以省略(lve)該(gai)步驟(zhou)。

　　(2)將細(xi)胞(bao)懸浮液收(shou)集到(dao)離心管中，以 1000×g 離心 10 分(fen)鐘(zhong)，然後吸(xi)去培(pei)養基，用預冷PBS 洗(xi)滌(di)細(xi)胞(bao) 3 次。

　　(3)加入適量的(de)預冷 PBS(建議(yi)在使(shi)用前(qian)立即加(jia)入蛋白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑(ji))重(zhong)懸細(xi)胞(bao)。在 6 孔培(pei)養板中，每(mei)個孔 需要(yao) 150-250μL 的(de) PBS 來(lai)重(zhong)懸細(xi)胞(bao)。

　　(4) 使樣本(ben)在-20℃或(huo)-80℃條(tiao)件和(he)室溫(wen)條件下反(fan)復凍(dong)融(rong)，重(zhong)復凍(dong)融(rong)過(guo)程(cheng)數(shu)次(ci)，直(zhi)至細(xi)胞(bao)裂解(jie)。也可(ke) 以使用超(chao)聲波細(xi)胞(bao)破碎器(qi)超聲(sheng)處理(li)懸(xuan)浮液來(lai)裂解(jie)細(xi)胞(bao)。

　　(5) 4℃下以 10,000×g 離心 10 分(fen)鐘(zhong)，去除細(xi)胞(bao)碎片，收(shou)集上(shang)清液， -20℃或(huo)-80℃保(bao)存(cun)，避(bi)免反(fan)復凍(dong)融(rong)。

　　5. 組(zu)織(zhi)勻(yun)漿(jiang)

　　(1) 用預冷的(de) PBS(0.01M，PH7.4)沖洗(xi)組織(zhi)以除去表面(mian)殘(can)留(liu)的(de)血液或(huo)雜(za)質。

　　(2) 將組織(zhi)塊(kuai)稱重(zhong)，然後(hou)切成盡可(ke)能小(xiao)的(de)碎(sui)塊(kuai)，以便(bian)充(chong)分(fen)勻(yun)漿(jiang)。

　　(3) 加入適量的(de)預冷 PBS(體(ti)積取(qu)決於組織(zhi)的(de)重(zhong)量，9 mL PBS 適用於(yu) 1 g 組織，建議(yi)使用前(qian)立即在 PBS 中加入適量蛋白(bai)酶抑(yi)制(zhi)劑(ji))，用玻(bo)璃(li)勻(yun)漿(jiang)器(qi)在冰(bing)上(shang)或冰(bing)浴中充(chong)分(fen)勻(yun)漿(jiang)。

　　(4) 將勻(yun)漿(jiang)液吸(xi)入離(li)心管中，4℃ 下以 5000×g 離心 5~10 分(fen)鐘(zhong)，收(shou)集上(shang)清液，保(bao)存(cun)至-20℃或-80℃， 避(bi)免反(fan)復凍(dong)融(rong)。

　　壹(yi)般(ban)來說(shuo)，由於 ELISA 實驗只能檢(jian)測(ce)可(ke)溶(rong)性蛋白(bai)質(zhi)的(de)含(han)量(liang)，因此要(yao)求(qiu)樣本(ben)應(ying)清(qing)晰透(tou)明(ming)並離心除去沈(chen)澱(dian)物(wu)或懸浮物質(zhi)。為確保(bao)實驗的(de)準(zhun)確性， -20℃或-80℃保(bao)存(cun)的(de)樣本(ben)應(ying)在 1-6個月(yue)內(nei)完(wan)成檢測(ce)，4℃保(bao)存(cun)的(de)樣本(ben)在壹(yi)周(zhou)內(nei)完(wan)成檢測(ce)。

　　問題(ti)二(er):ELISA法(fa)壹般(ban)都能(neng)檢測血清(qing)、血漿(jiang)和(he)細(xi)胞(bao)上(shang)清嗎(ma)?

　　答(da):不(bu)能(neng)。原(yuan)因主要(yao)從指(zhi)標適應性(xing)和(he)體系(xi)適應性(xing)2個方(fang)面(mian)來(lai)說明(ming)。

　　首先，我(wo)們要(yao)根(gen)據既(ji)往(wang)的(de)研究和(he)文獻(xian)報道(dao)確認，我們所(suo)檢(jian)測(ce)的(de)靶(ba)標是(shi)否(fou)在血清(qing)、血漿(jiang)中有(you)正常(chang)表達(da)，是(shi)否在疾(ji)病(bing)狀態(tai)，特殊生理(li)時(shi)期，特定(ding)的(de)生(sheng)物鐘(zhong)時(shi)會(hui)分(fen)泌(mi)表達(da)，如(ru)果以上(shang)幾種(zhong)情(qing)況都(dou)不存在，或(huo)者(zhe)暫(zan)時沒(mei)有(you)研究結果支持，那(na)麽(me)使用血清(qing)或血漿(jiang)檢測(ce)可(ke)能無(wu)信(xin)號(hao)值(zhi)。另外，ELISA 方法(fa)並不(bu)是只(zhi)能檢(jian)測(ce)分(fen)泌(mi)性靶標，某(mou)些(xie)靶(ba)標(biao)經適當(dang)的(de)裂(lie)解(jie)作用後(hou)，釋(shi)放(fang)出靶標(biao)蛋白(bai)的(de)樣本(ben)同(tong)樣可(ke)以進行(xing)檢(jian)測，目前我(wo)們(men)的(de)產品(pin)中也有(you)不少(shao)此類(lei)靶標(biao)。再(zai)說(shuo)，細(xi)胞(bao)上(shang)清樣本(ben)。同(tong)樣的(de)，需要(yao)根(gen)據既(ji)往(wang)的(de)研究和(he)文獻(xian)報道(dao)或(huo)者(zhe)客戶的(de)實驗設計(ji)確認，我們所(suo)檢(jian)測(ce)的(de)靶(ba)標是(shi)否(fou)分(fen)泌(mi)到上(shang)清中，如果無(wu)研究和(he)文獻(xian)支持(chi)，那(na)麽(me)檢測可(ke)能無(wu)信(xin)號(hao)值(zhi)。也就是不(bu)適合(he)使用上(shang)清樣本(ben)檢(jian)測(ce)。

　　其(qi)次，我們(men)使(shi)用的(de)血清(qing)、血漿(jiang)、細(xi)胞(bao)上(shang)清樣本(ben)屬於復(fu)雜(za)基質(zhi)的(de)樣本(ben)，常(chang)常(chang)混(hun)合(he)了(le)其他(ta)與(yu)靶(ba)標蛋白(bai)可(ke)能發生(sheng)結合(he)的(de)或(huo)者(zhe)多種(zhong)非(fei)特異(yi)性物(wu)質(zhi)造成的(de)對(dui)檢(jian)測(ce)靶(ba)標蛋白(bai)的(de)幹擾，也就是基質(zhi)效(xiao)應。那(na)麽(me)我們的(de) ELISA 產品(pin)要(yao)適應這(zhe)樣的(de)情(qing)況，則需要(yao)使(shi)用適當(dang)的(de)生(sheng)產體(ti)系(xi)和(he)測試(shi)體系(xi)來(lai)解(jie)決這樣的(de)問題(ti)。這就是我(wo)們(men)的(de)檢(jian)測體(ti)系(xi)從外觀看都壹(yi)樣，但是(shi)實際成分(fen)不(bu)壹樣的(de)原(yuan)因。當(dang)體(ti)系(xi)不(bu)合(he)適時，可(ke)能存(cun)在嚴(yan)重(zhong)的(de)基質(zhi)效(xiao)應無(wu)法(fa)消(xiao)除，從而幹擾測(ce)試(shi)的(de)準(zhun)確性。也就是為何(he)，有(you)的(de)產品(pin)只(zhi)能檢(jian)測血清(qing)、血漿(jiang)，有(you)的(de)產品(pin)只(zhi)能檢(jian)測細(xi)胞(bao)上(shang)清了(le)。

　　問題(ti)三(san):為什(shen)麽(me)要(yao)做(zuo)預實驗?

　　答(da):通(tong)過(guo)預實驗可(ke)以確定(ding)樣本(ben)的(de)大(da)致(zhi)濃度範(fan)圍(wei)，防(fang)止樣本(ben)濃度過(guo)高(gao)或(huo)者(zhe)過(guo)低得(de)不(bu)到較(jiao)好的(de)結果，同時也可(ke)以節約樣本(ben)和(he)試(shi)劑盒。

　　問題(ti)四:預實驗做過(guo)標(biao)曲(qu)，正(zheng)式(shi)實驗還(hai)需要(yao)做(zuo)標曲(qu)嗎(ma)?

　　答(da):需要(yao)。原(yuan)因是避(bi)免出現樣本(ben)全(quan)陰性(xing)時(shi)無(wu)陽性(xing)對(dui)照(zhao)。

　　問題(ti)五(wu):怎麽(me)解(jie)釋(shi)樣本(ben)越稀釋(shi)濃度值(zhi)越高?

　　答(da):壹(yi)種(zhong)原因是樣本(ben)受(shou)基質(zhi)效(xiao)應的(de)影(ying)響(xiang)。通過(guo)剃度稀(xi)釋(shi)可(ke)以消(xiao)除基質(zhi)的(de)影(ying)響(xiang)，稀釋(shi)過(guo)後(hou)的(de)樣本(ben)濃度會(hui)出現先升(sheng)高再(zai)下(xia)降的(de)趨(qu)勢。

　　另壹種(zhong)原因是樣本(ben)受(shou)藥物的(de)影(ying)響(xiang)。

　　elisa試(shi)劑盒本(ben)生(sheng)壹(yi)直(zhi)視質(zhi)量控(kong)制(zhi)為企(qi)業(ye)的(de)生(sheng)命，追(zhui)求企(qi)業(ye)競(jing)爭(zheng)力(li)的(de)不(bu)斷提(ti)升。公(gong)司(si)在經營(ying)中始終(zhong)秉承(cheng)：遵(zun)紀(ji)守(shou)法(fa)，嚴於(yu)律(lv)己，寬(kuan)仁(ren)以待，敢(gan)於(yu)承(cheng)擔(dan)的(de)企(qi)業(ye)精(jing)神(shen)作為標(biao)準(zhun)，以過(guo)硬(ying)的(de)質(zhi)量和(he)優良(liang)的(de)服(fu)務來(lai)維(wei)護和(he)拓(tuo)展(zhan)市場，較(jiao)大(da)限度的(de)滿足客(ke)戶的(de)需求(qiu)。與(yu)客(ke)戶的(de)共(gong)贏，是(shi)我(wo)們(men)的(de)發展(zhan)目標。本(ben)生(sheng)!您(nin)信(xin)任(ren)的(de)合(he)作夥(huo)伴(ban)。我們(men)願(yuan)與(yu)您(nin)真(zhen)誠合(he)作，共創(chuang)美(mei)好的(de)未來。