BUNSEN本(ben)生——酶聯免(mian)疫(yi)吸附試驗(ELISA)操作要點(dian)

　　壹(yi)、摘(zhai)要(yao)：

　　1.標本(ben)的(de)采(cai)取和保(bao)存

　　可(ke)用(yong)作(zuo)elisa測(ce)定(ding)的(de)標本(ben)十分(fen)廣泛，體(ti)液(ye)(如血(xue)清(qing))、分(fen)泌物(唾液(ye))和排(pai)泄(xie)物(如尿液(ye)、糞便(bian))等均(jun)可(ke)作(zuo)標本(ben)以測(ce)定(ding)其中某種抗體(ti)或抗原(yuan)成份(fen)。有(you)些(xie)標本(ben)可(ke)直(zhi)接進(jin)行(xing)測(ce)定(ding)(如(ru)血(xue)清(qing)、尿(niao)液(ye))，有(you)些(xie)則(ze)需(xu)經(jing)預(yu)處理(如糞便(bian)和某(mou)些(xie)分(fen)泌物)。大部分(fen)ELISA檢(jian)測(ce)均(jun)以(yi)血(xue)清(qing)為(wei)標本(ben)。血漿(jiang)中除尚含(han)有(you)纖(xian)維蛋(dan)白原(yuan)和抗凝劑(ji)外，其他(ta)成份(fen)均同等於(yu)血清(qing)。制(zhi)備(bei)血(xue)漿(jiang)標本(ben)需(xu)借助於(yu)抗凝劑(ji)，而血(xue)清(qing)標本(ben)只要(yao)待血(xue)清(qing)自然(ran)凝固(gu)、血(xue)kuai收縮(suo)後(hou)即(ji)可(ke)取(qu)得(de)。除(chu)特殊(shu)情況外，在醫學(xue)檢(jian)驗中均以血(xue)清(qing)作(zuo)為(wei)檢(jian)測(ce)標本(ben)。在ELISA中血漿(jiang)和血(xue)清(qing)可(ke)同(tong)等應用(yong)。血(xue)清(qing)標本(ben)可(ke)按(an)常規方(fang)法采集(ji)，應註(zhu)意避免(mian)溶血(xue)，紅(hong)細胞(bao)溶解(jie)時會釋放(fang)出(chu)具有(you)過氧(yang)化(hua)物酶活(huo)性(xing)的(de)物質，以(yi)HRP為標記(ji)的(de)ELISA測(ce)定(ding)中，溶血標本(ben)可(ke)能(neng)會(hui)增(zeng)加(jia)非特(te)異(yi)性(xing)顯色(se)。 血(xue)清(qing)標本(ben)宜(yi)在(zai)新(xin)鮮(xian)時檢(jian)測(ce)。如(ru)有(you)細(xi)菌汙(wu)染(ran)，菌體(ti)中可(ke)能(neng)含(han)有(you)內源(yuan)性(xing)HRP，也會(hui)產(chan)生假(jia)陽性(xing)反應。如(ru)在(zai)冰箱(xiang)中保存過久(jiu)，其中的(de)可(ke)發(fa)生聚(ju)合，在(zai)間接(jie)法ELISA中可(ke)使本(ben)底加(jia)深。壹(yi)般(ban)說(shuo)來(lai)，在5天(tian)內測(ce)定(ding)的(de)血(xue)清(qing)標本(ben)可(ke)放(fang)置於(yu)4℃，超過壹(yi)周測(ce)定(ding)的(de)需(xu)低(di)溫冰存。凍(dong)結(jie)血清(qing)融解(jie)後(hou)，蛋(dan)白質局(ju)部濃(nong)縮，分(fen)布不均(jun)，應充(chong)分(fen)混勻宜(yi)輕(qing)緩(huan)，避免(mian)氣泡(pao)，可(ke)上(shang)下顛倒(dao)混和，不要(yao)在混勻器上(shang)強(qiang)烈(lie)振(zhen)蕩(dang)。混濁(zhuo)或(huo)有(you)沈(chen)澱(dian)的(de)血(xue)清(qing)標本(ben)應先(xian)離心或過濾(lv)，澄清(qing)後(hou)再檢(jian)測(ce)。反(fan)復凍(dong)融會(hui)使抗體(ti)效(xiao)價跌(die)落(luo)，所以測(ce)抗體(ti)的(de)血(xue)清(qing)標本(ben)如需(xu)保存作(zuo)多(duo)次檢(jian)測(ce)，宜(yi)少量(liang)分(fen)裝冰存。保(bao)存血(xue)清(qing)自采(cai)集(ji)時就(jiu)應註(zhu)意無菌操作(zuo)，也(ye)可(ke)加(jia)入適當防(fang)腐(fu)劑(ji)。

　　2.加(jia)樣

　　在(zai)ELISA中壹(yi)般(ban)有(you)3次(ci)加(jia)樣步(bu)聚(ju)，即加(jia)標本(ben)，加(jia)酶結合(he)物，加(jia)底物。加(jia)樣時應將(jiang)所加(jia)物加(jia)在LEISA板(ban)孔的(de)底部，避免(mian)加(jia)在孔(kong)壁上(shang)部(bu)，並註(zhu)意不可(ke)濺出(chu)，不可(ke)產(chan)生氣(qi)泡(pao)。 加(jia)標本(ben)壹(yi)般(ban)用(yong)微量(liang)加(jia)樣器，按(an)規定(ding)的(de)量(liang)加(jia)入板(ban)孔中。每(mei)次(ci)加(jia)標本(ben)應更(geng)換(huan)吸(xi)嘴(zui)，以(yi)免(mian)發(fa)生交(jiao)叉(cha)汙(wu)染(ran)，也可(ke)用(yong)壹(yi)次(ci)性(xing)的(de)定(ding)量塑料管(guan)加(jia)樣。有(you)此(ci)測(ce)定(ding)(如(ru)間接(jie)法ELISA)需(xu)用稀(xi)釋的(de)血(xue)清(qing)，可(ke)在(zai)試管中按(an)規定(ding)的(de)稀(xi)釋度稀(xi)釋後(hou)再加(jia)樣。也(ye)可(ke)在(zai)板(ban)孔中加(jia)入稀(xi)釋液(ye)，再在其中加(jia)入血清(qing)標本(ben)，然後(hou)在微型(xing)震(zhen)蕩(dang)器上(shang)震(zhen)蕩(dang)1分(fen)鐘以保(bao)證混(hun)和。加(jia)酶結合(he)物應用(yong)液(ye)和底物應用(yong)液(ye)時可(ke)用(yong)定(ding)量(liang)多(duo)道加(jia)液(ye)器，使加(jia)液(ye)過程(cheng)迅速完成(cheng)。

　　3.試劑(ji)的(de)準(zhun)備(bei)

　　按(an)試劑(ji)盒(he)說明(ming)書(shu)的(de)要(yao)求準備(bei)實驗中需(xu)用的(de)試劑(ji)。ELISA中用的(de)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)或(huo)去(qu)離子水(shui)，包(bao)括(kuo)用(yong)於(yu)洗滌(di)的(de)，應為(wei)新(xin)鮮(xian)的(de)和高(gao)質量(liang)的(de)。自配(pei)的(de)緩(huan)沖液(ye)應用(yong)pH計測(ce)量(liang)較正(zheng)。從(cong)冰箱(xiang)中取出(chu)的(de)試驗用試劑(ji)應待溫度與室溫平衡(heng)後使用。試劑(ji)盒(he)中本(ben)次試驗不需(xu)用的(de)部(bu)分(fen)應及(ji)時放(fang)回(hui)冰(bing)箱(xiang)保存。

　　4. 保(bao)溫

　　在ELISA中壹(yi)般(ban)有(you)兩次抗原(yuan)抗體(ti)反應，即(ji)加(jia)標本(ben)和加(jia)酶結合(he)物後。抗原(yuan)抗體(ti)反應的(de)完成(cheng)需(xu)要有(you)壹(yi)定(ding)的(de)溫度和時間，這壹(yi)保(bao)溫過程(cheng)稱(cheng)為溫育(incubation)，有(you)人稱之(zhi)為(wei)孵育，在ELISA中似不恰當(dang)。 ELISA屬(shu)固(gu)相(xiang)免(mian)疫(yi)測(ce)定(ding)，抗原(yuan)、抗體(ti)的(de)結(jie)合只在(zai)固(gu)相(xiang)表面(mian)上(shang)發(fa)生。以(yi)抗體(ti)包(bao)被的(de)夾(jia)心法為例(li)，加(jia)入板(ban)孔中的(de)標本(ben)，其中的(de)抗原(yuan)並不是都有(you)均(jun)等的(de)和固(gu)相(xiang)抗結(jie)合的(de)機(ji)會，只有(you)zui貼近(jin)孔壁的(de)壹(yi)層(ceng)溶(rong)液(ye)中的(de)抗原(yuan)直(zhi)接與抗體(ti)接觸(chu)。這是壹(yi)個(ge)逐(zhu)步(bu)平衡(heng)的(de)過程(cheng)，因(yin)此(ci)需(xu)經(jing)擴散才(cai)能(neng)達到反(fan)應的(de)終(zhong)點(dian)。在其後(hou)加(jia)入的(de)酶標記(ji)抗體(ti)與固(gu)相(xiang)抗原(yuan)的(de)結(jie)合也同樣(yang)如此。這就(jiu)是為什(shen)麽ELISA反(fan)應總(zong)是需(xu)要壹(yi)定(ding)時間的(de)溫育。

　　溫育常(chang)采(cai)用的(de)溫度有(you)43℃、37℃、室溫和4℃(冰(bing)箱(xiang)溫度)等。37℃是實驗室中常用的(de)保(bao)溫溫度，也(ye)是大多(duo)數抗原(yuan)抗體(ti)結合(he)的(de)合(he)適溫度。在(zai)建(jian)立ELISA方(fang)法作反(fan)應動(dong)力(li)學(xue)研究時，實驗表明，兩次抗原(yuan)抗體(ti)反應壹(yi)般(ban)在(zai)37℃經(jing)1-2小(xiao)時，產物的(de)生成(cheng)可(ke)達。為加(jia)速反(fan)應，可(ke)提(ti)高(gao)反應的(de)溫度，有(you)些(xie)試驗在43℃進行(xing)，但(dan)不宜(yi)采(cai)用(yong)更(geng)高(gao)的(de)溫度。抗原(yuan)抗體(ti)反應4℃更(geng)為*，以(yi)形(xing)成zui多(duo)的(de)沈(chen)澱(dian)。但因(yin)所需(xu)時間太長，在ELISA中壹(yi)般(ban)不予(yu)采(cai)用。

　　ELISA試劑(ji)盒(he) 本(ben)生壹(yi)直(zhi)視(shi)質量(liang)控(kong)制(zhi)為(wei)企業(ye)的(de)生命(ming)，追求企業(ye)競爭力(li)的(de)不斷(duan)提(ti)升。公(gong)司(si)在經(jing)營(ying)中始終(zhong)秉(bing)承：遵(zun)紀(ji)守法，嚴於(yu)律己(ji)，寬(kuan)仁以待，敢於(yu)承擔(dan)的(de)企(qi)業(ye)精(jing)神作(zuo)為(wei)標準(zhun)，以過硬的(de)質量(liang)和優(you)良(liang)的(de)服(fu)務(wu)來(lai)維護(hu)和拓(tuo)展(zhan)市場，較大限(xian)度的(de)滿(man)足客(ke)戶(hu)的(de)需(xu)求。與客(ke)戶(hu)的(de)共(gong)贏，是我(wo)們(men)的(de)發(fa)展(zhan)目(mu)標。本(ben)生!您信(xin)任(ren)的(de)合(he)作夥伴。我(wo)們(men)願(yuan)與您真(zhen)誠合作，共(gong)創(chuang)美(mei)好(hao)的(de)未(wei)來(lai)。