超(chao)氧化物(wu)歧(qi)化酶(mei)（Superoxide Dismutase,  SOD）試(shi)劑(ji)盒說(shuo)明(ming)書(shu)（WST-8法(fa)）

                                                分(fen)光(guang)光(guang)度(du)法(fa)50管/48樣 天(tian)津(jin)本生

正(zheng)式(shi)測(ce)定(ding)務必(bi)取(qu)2-3個預期差(cha)異(yi)較大(da)的(de)樣本(ben)做預(yu)測定(ding)                                            

測定(ding)意義(yi)：

SOD（EC  1.15.1.1）廣(guang)泛存在(zai)於(yu)動(dong)物(wu)、植物(wu)、微(wei)生物(wu)和培(pei)養細(xi)胞中，催(cui)化超(chao)氧化物(wu)陰(yin)離子(zi)發生(sheng)岐(qi)化作(zuo)用(yong)，生成(cheng)H2O2和O2。SOD不僅(jin)是(shi)超(chao)氧化物(wu)陰(yin)離子(zi)清除(chu)酶(mei)，也是(shi)H2O2主(zhu)要(yao)生成(cheng)酶(mei)，在(zai)生物抗(kang)氧(yang)化系(xi)統中具(ju)有(you)重要作(zuo)用。

測(ce)定(ding)原理(li)：

通(tong)過(guo)huangpl及huangpl氧(yang)化酶(mei)反應(ying)系(xi)統產生超(chao)氧陰(yin)離子(zi)(O2-.)，O2-.可(ke)與WST-8反應(ying)產生水(shui)溶性染料甲(jia)臜(臜)，後者(zhe)在(zai)450nm處有(you)吸收(shou)；SOD可(ke)清(qing)除(chu)O2-.，從(cong)而(er)抑(yi)制了甲(jia)臜(臜)的形(xing)成(cheng)；反應(ying)液(ye)黃(huang)色(se)越深(shen)，說(shuo)明(ming)SOD活(huo)性愈(yu)低(di)，反(fan)之(zhi)活(huo)性越高。

組成(cheng)：

自(zi)備儀(yi)器和(he)用品：

分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計、離心機、移(yi)液(ye)器(qi)、1ml玻璃(li)比色(se)皿、研(yan)缽(bo)、冰和(he)蒸餾(liu)水

粗(cu)酶(mei)液(ye)提(ti)取(qu)：

1、細(xi)菌、細(xi)胞或(huo)組織(zhi)樣(yang)品(pin)的(de)制備：

細(xi)菌或(huo)培(pei)養細(xi)胞：先(xian)收(shou)集(ji)細(xi)菌或(huo)細(xi)胞到(dao)離心管內，離心後棄上清(qing)；按照細(xi)菌或(huo)細(xi)胞數量（104個）：提取(qu)液(ye)體(ti)積（ml）為(wei)500~1000：1的比例(li)（建(jian)議(yi)500萬細(xi)菌或(huo)細(xi)胞加(jia)入1ml提(ti)取(qu)液(ye)），超(chao)聲(sheng)波(bo)破(po)碎細(xi)菌或(huo)細(xi)胞（冰(bing)浴(yu)，功(gong)率20％或200W，超(chao)聲(sheng)3s，間(jian)隔(ge)10s，重復(fu)30次）；8000g  4℃離心10min，取(qu)上清(qing)，置冰(bing)上待測。

組織(zhi)：按照組織(zhi)質(zhi)量（g）：提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積(ml)為(wei)1：5~10的比例(li)（建(jian)議(yi)稱取(qu)約0.1g組織(zhi)，加(jia)入1ml提(ti)取(qu)液(ye)），進行(xing)冰浴(yu)勻漿(jiang)。8000g  4℃離心10min，取(qu)上清(qing)，置冰(bing)上待測。

2、血清（漿(jiang)）樣品(pin)：直接(jie)檢測(ce)。

測定(ding)步驟：

1、 分(fen)光(guang)光(guang)度(du)計預熱(re)30min以上(shang)，調節(jie)波(bo)長至(zhi)450nm，蒸餾(liu)水調零(ling)。

2、 試(shi)劑(ji)三的(de)稀釋(shi)：將(jiang)試(shi)劑(ji)三用(yong)蒸餾(liu)水稀釋(shi)50倍，用(yong)多(duo)少(shao)配(pei)多(duo)少(shao)。（試(shi)劑(ji)三和(he)蒸餾(liu)水1：49稀釋(shi)。

3、  工作(zuo)液(ye)配(pei)制：在(zai)試(shi)劑(ji)壹加(jia)入250μl試(shi)劑(ji)二，充分(fen)混(hun)勻。配好(hao)的試(shi)劑(ji)4℃避光(guang)可(ke)保存壹(yi)周(zhou)。（若壹(yi)次性測定(ding)樣本(ben)較(jiao)少(shao)，可(ke)按照實際(ji)用量將(jiang)試(shi)劑(ji)壹和(he)試(shi)劑(ji)二按照20ml：0.1ml的比例(li)混(hun)勻配(pei)制）

4、 將(jiang)壹瓶(ping)試(shi)劑(ji)四用(yong)5ml蒸餾(liu)水溶(rong)解（溶解後壹周(zhou)內用(yong)完(wan)）。

5、 樣(yang)本(ben)測定(ding)（在(zai)1ml玻璃(li)比色(se)皿中依次加入下(xia)列(lie)試(shi)劑(ji)）

充分(fen)混(hun)勻，室溫靜(jing)置(zhi)30min後，450nm處測(ce)定(ding)各管吸光(guang)值(zhi)A。

註(zhu)意事項(xiang):

1、試(shi)劑(ji)三為(wei)酶(mei)，不可(ke)冷(leng)凍(dong)，使(shi)用時在(zai)冰上放(fang)置(zhi)。

2、對(dui)照管只需要做壹(yi)管。

3、SOD為(wei)什麽有的樣本(ben)測(ce)定(ding)管大(da)於(yu)對(dui)照管，對(dui)照管數值(zhi)在(zai)什麽範圍？

對(dui)照管的範(fan)圍是(shi)0.8-2。對(dui)照管吸光(guang)值(zhi)過低可(ke)能(neng)是(shi)（1）試(shi)劑(ji)三活(huo)性低，可(ke)以(yi)適當(dang)減少(shao)稀釋(shi)倍數；（2)沒有按順序加(jia)試(shi)劑(ji)；（3）反應(ying)時間不夠(gou)，可(ke)以(yi)延(yan)長反應(ying)時間（反(fan)應(ying)時間30min可(ke)以(yi)延(yan)長到(dao)40min）。對(dui)照管吸光(guang)值(zhi)過高可(ke)能(neng)是(shi)試(shi)劑(ji)三未按操作說(shuo)明(ming)書(shu)稀釋(shi)相應(ying)倍(bei)數。

若出(chu)現(xian)測(ce)定(ding)管大(da)於(yu)對(dui)照管，可(ke)能(neng)是(shi)樣本(ben)中雜(za)質(zhi)的影(ying)響(xiang)太(tai)大(da)，為(wei)了降低雜質(zhi)的影(ying)響(xiang)壹(yi)般將(jiang)樣本(ben)提(ti)取(qu)上清(qing)液(ye)用(yong)蒸餾(liu)水或(huo)提取(qu)液(ye)稀釋(shi)10倍後再測(ce)，通(tong)常(chang)可(ke)以(yi)使(shi)測(ce)定(ding)正常(chang)。計算公(gong)式(shi)中乘(cheng)以(yi)相應(ying)稀釋(shi)倍數。

SOD活(huo)性計算：

1、抑(yi)制百(bai)分(fen)率的計算

抑(yi)制百(bai)分(fen)率＝(A對(dui)照管－A測定(ding)管) ÷A對(dui)照管× 100%

盡量(liang)使樣(yang)本(ben)的(de)抑(yi)制百(bai)分(fen)率在(zai)10-90%範圍內(nei)。如(ru)果(guo)計算出(chu)來的(de)抑(yi)制百(bai)分(fen)率小於(yu)10%或大(da)於(yu)90%，則通常(chang)需要調整(zheng)加(jia)樣量(liang)後重新測(ce)定(ding)。如果(guo)測(ce)定(ding)出來(lai)的(de)抑(yi)制百(bai)分(fen)率偏高，則需將(jiang)樣本(ben)用(yong)提(ti)取(qu)液(ye)適當(dang)稀釋(shi)；如果(guo)測(ce)定(ding)出來(lai)的(de)抑(yi)制百(bai)分(fen)率偏低，則需重新準備濃(nong)度(du)比較高的(de)待測樣(yang)本。

2、SOD酶(mei)活(huo)性單位(wei)：在(zai)上述huangpl氧(yang)化酶(mei)藕聯(lian)反(fan)應(ying)體(ti)系中抑(yi)制百(bai)分(fen)率為(wei)50%時，反應(ying)體(ti)系中的(de)SOD酶(mei)活(huo)力定(ding)義為(wei)壹個酶(mei)活(huo)力單(dan)位(wei)(U/ml)。

3、SOD酶(mei)活(huo)性計算：

（1）血清（漿(jiang)）SOD活(huo)性(U/ml)=[抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑(yi)制百(bai)分(fen)率)×V反總(zong)]÷V樣(yang)=20×抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑(yi)制百(bai)分(fen)率)

（2）組織(zhi)、細(xi)菌或(huo)培(pei)養細(xi)胞SOD活(huo)力計算：

a.按樣本蛋(dan)白(bai)濃(nong)度(du)計算

SOD活(huo)性(U/mg prot)=[抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑(yi)制百(bai)分(fen)率)×V反總(zong)]÷(V樣(yang)×Cpr) =20×抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑(yi)制百(bai)分(fen)率)÷Cpr

需要另(ling)外測定(ding)，建(jian)議(yi)使(shi)用(yong)本(ben)公(gong)司(si)BCA蛋(dan)白(bai)質(zhi)含量(liang)測(ce)定(ding)試(shi)劑(ji)盒。

b.按樣本鮮重計算

SOD活(huo)性(U/g 鮮重)=[抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑(yi)制百(bai)分(fen)率)×V反總(zong)]÷(W ×V樣(yang)÷V樣(yang)總(zong))=20×抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑(yi)制百(bai)分(fen)率)÷W

c.按細(xi)菌或(huo)細(xi)胞個數計算

SOD活(huo)力(U/104 cell)=[抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑(yi)制百(bai)分(fen)率)  ×V反總(zong)]÷(500×V樣(yang)÷V樣(yang)總(zong)) =0.04×抑(yi)制百(bai)分(fen)率÷(1－抑(yi)制百(bai)分(fen)率)

V反總(zong)：反(fan)應(ying)體(ti)系總(zong)體(ti)積，1ml；V樣：加入反(fan)應(ying)體(ti)系中樣(yang)本(ben)體(ti)積，0.05ml；V樣總(zong)：加(jia)入提(ti)取(qu)液(ye)體(ti)積，1 ml；Cpr：樣本蛋(dan)白(bai)質(zhi)濃(nong)度(du)，mg/ml  ；W：樣本質(zhi)量，g；500：細(xi)胞或(huo)細(xi)菌總(zong)數，500萬。