本(ben)生(sheng)新(xin)聞:ELISA試劑盒(he)細胞的裂(lie)解方法(fa)!

　　細胞裂(lie)解是(shi)改(gai)變(bian)細胞通(tong)透(tou)性和(he)活(huo)性的(de)重(zhong)要(yao)實驗方法(fa)。那(na)麽(me)，到(dao)底要(yao)如(ru)何裂(lie)解細胞呢?不妨來(lai)看(kan)下(xia)本(ben)生(sheng)生(sheng)物(wu)的詳(xiang)述：

　　對於(yu)培養(yang)細胞樣(yang)品：

　　1.融解(jie)ripa裂(lie)解液(ye)，混勻(yun)。取適(shi)當(dang)量(liang)的(de)裂(lie)解液(ye)，在使(shi)用前數(shu)分鐘(zhong)內加(jia)入(ru)pmsf，使pmsf的(de)終(zhong)濃度(du)為(wei)1mm。

　　2.對於(yu)貼(tie)壁細胞：去(qu)除(chu)培養(yang)液(ye)，用pbs、生理(li)鹽(yan)水(shui)或(huo)無(wu)血清(qing)培養(yang)液(ye)洗(xi)壹遍(如(ru)果血(xue)清(qing)中(zhong)的蛋(dan)白(bai)沒有(you)幹擾，可(ke)以不洗(xi))。按(an)照(zhao)6孔(kong)板(ban)每(mei)孔(kong)加(jia)入(ru)150-250微(wei)升裂(lie)解液(ye)的比(bi)例(li)加(jia)入裂(lie)解液(ye)。用槍吹(chui)打(da)數(shu)下(xia)，使(shi)裂(lie)解液(ye)和細胞充分(fen)接(jie)觸。通(tong)常(chang)裂(lie)解液(ye)接觸(chu)細胞1-2秒後，細胞就(jiu)會被裂(lie)解。

　　對(dui)於(yu)懸浮(fu)細胞：離心收集細胞，用手指(zhi)把細胞用力彈(dan)散(san)。按(an)照(zhao)6孔(kong)板(ban)每(mei)孔(kong)細胞加入(ru)150-250微(wei)升裂(lie)解液(ye)的比(bi)例(li)加(jia)入裂(lie)解液(ye)。再用手指(zhi)輕(qing)彈以充(chong)分裂(lie)解細胞。充分(fen)裂(lie)解後應(ying)沒有(you)明顯的(de)細胞沈(chen)澱(dian)。如(ru)果細胞量較(jiao)多，必(bi)需(xu)分(fen)裝成50-100萬細胞/管(guan)，然後再(zai)裂(lie)解。

　　3.充(chong)分裂(lie)解後，10000-14000g離心3-5分(fen)鐘(zhong)，取上清(qing)，即(ji)可進行後續(xu)的(de)page、western和(he)免(mian)疫(yi)沈(chen)澱(dian)等(deng)操作。

　　裂(lie)解液(ye)用量說(shuo)明：通(tong)常(chang)6孔(kong)板(ban)每(mei)孔(kong)細胞加入(ru)150微(wei)升裂(lie)解液(ye)已經(jing)足夠，但如(ru)果細胞密度(du)非(fei)常(chang)高(gao)可(ke)以適(shi)當(dang)加(jia)大裂(lie)解液(ye)的用量到(dao)200微升(sheng)或(huo)250微(wei)升(sheng)。

　　對(dui)於(yu)組織(zhi)樣(yang)品：

　　1.把組織(zhi)剪(jian)切(qie)成細小的(de)碎(sui)片(pian)。

　　2.融解(jie)ripa裂(lie)解液(ye)，混勻(yun)。取適(shi)當(dang)量(liang)的(de)裂(lie)解液(ye)，在使(shi)用前數(shu)分鐘(zhong)內加(jia)入(ru)pmsf，使pmsf的(de)終(zhong)濃度(du)為(wei)1mm。

　　3.按(an)照(zhao)每(mei)20毫克(ke)組織(zhi)加入(ru)150-250微升裂(lie)解液(ye)的比(bi)例(li)加(jia)入裂(lie)解液(ye)。(如(ru)果裂(lie)解不充(chong)分可(ke)以適(shi)當(dang)添加更多的裂(lie)解液(ye)，如(ru)果需(xu)要(yao)高(gao)濃度(du)的(de)蛋白(bai)樣(yang)品，可以適(shi)當(dang)減少(shao)裂(lie)解液(ye)的用量。)

　　4.用玻(bo)璃(li)勻漿(jiang)器勻漿(jiang)，直至(zhi)充分裂(lie)解。

　　5.充(chong)分裂(lie)解後，10000-14000g離心3-5分(fen)鐘(zhong)，取上清(qing)，即(ji)可進行後續(xu)的(de)page、western和(he)免(mian)疫(yi)沈(chen)澱(dian)等(deng)操作。

　　6.如(ru)果組(zu)織樣(yang)品本(ben)身非常(chang)細小，可(ke)以適(shi)當(dang)剪(jian)切(qie)後直(zhi)接(jie)加(jia)入(ru)裂(lie)解液(ye)裂(lie)解，通(tong)過強烈(lie)vortex使樣(yang)品裂(lie)解充(chong)分。然(ran)後同(tong)樣(yang)離心取上清(qing)，用於(yu)後續(xu)實驗。直接(jie)裂(lie)解的(de)優點(dian)是(shi)比(bi)較(jiao)方便(bian)，不必(bi)使用勻漿(jiang)器，缺點(dian)是(shi)不如(ru)使用勻漿(jiang)器那樣(yang)裂(lie)解得(de)比較(jiao)充(chong)分。

　　註(zhu)：ripa裂(lie)解液(ye)的裂(lie)解產(chan)物(wu)中(zhong)經常(chang)會出現壹小團(tuan)透(tou)明膠狀物(wu)，屬正常(chang)現象。該(gai)透(tou)明膠狀物(wu)為含有基(ji)因(yin)組(zu)dna等(deng)的(de)復(fu)合物(wu)。在不檢(jian)測和(he)基因(yin)組(zu)dna結(jie)合特別(bie)緊密(mi)的蛋白(bai)的(de)情況下，可(ke)以直(zhi)接離心取上清(qing)用於(yu)後續(xu)實驗;如(ru)果需(xu)要(yao)檢(jian)測和(he)基因(yin)組(zu)結(jie)合特別(bie)緊密(mi)的蛋白(bai)，則(ze)可以通(tong)過超聲處理打(da)碎(sui)打(da)散(san)該(gai)透(tou)明膠狀物(wu)，隨後離心取上清(qing)用於(yu)後續(xu)實驗。如(ru)果檢(jian)測壹些常(chang)見(jian)的(de)轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)，例(li)如(ru)nf-kappab、p53等(deng)時(shi)，通(tong)常(chang)不必(bi)進行超聲處理，就(jiu)可以檢(jian)測到(dao)這(zhe)些(xie)轉(zhuan)錄因(yin)子(zi)。