如(ru)何正確檢(jian)測(ce)ELISA試劑(ji)盒，有(you)什麽方法？

　　規(gui)格(ge)：96T 48T

　　用途：科(ke)研實驗(yan)(僅(jin)供(gong)實(shi)驗(yan)室(shi)研究使(shi)用)

　　保(bao)存(cun)：2-8℃。

　　有(you)效(xiao)期(qi)：6個月

　　結(jie)合(he)物的制(zhi)備

　　1. 戊(wu)二quan交聯(lian)法

　　戊(wu)二quan是壹種(zhong)雙功(gong)能(neng)團(tuan)試劑，它(ta)可(ke)以使(shi)酶(mei)與蛋白質的氨基(ji)通(tong)過它(ta)而(er)聯(lian)結(jie)。堿(jian)性(xing)磷酸(suan)壹(yi)般(ban)用此(ci)法(fa)進(jin)行標記。交聯(lian)方法(fa)壹(yi)步法、兩(liang)步法兩(liang)種(zhong)。在(zai)壹步法中(zhong)戊(wu)二quan直接(jie)加(jia)入(ru)酶(mei)與抗(kang)體的混合(he)物中(zhong)，反應(ying)後即(ji)得酶(mei)標記(ji)抗體。

　　ELISA中(zhong)常(chang)用的酶壹(yi)般(ban)都(dou)用此(ci)法(fa)交(jiao)聯(lian)。它(ta)具(ju)有(you)操(cao)作簡便(bian)、有(you)效(xiao)和(he)重(zhong)復性(xing)好(hao)等優點(dian)。缺(que)點(dian)是(shi)交聯(lian)反應(ying)是(shi)隨機的，酶與抗(kang)體交聯(lian)時(shi)分(fen)子間(jian)的比例不嚴格(ge)，結(jie)合(he)物的大小也(ye)不均壹，酶與酶(mei)，抗(kang)體與抗(kang)體之間(jian)也(ye)有(you)可(ke)能(neng)交(jiao)聯(lian)，影(ying)響(xiang)效(xiao)果。在(zai)兩步法中(zhong)，先(xian)將(jiang)酶(mei)與戊(wu)二quan作用，透(tou)析除去多(duo)余的戊(wu)二quan後，再(zai)與抗(kang)體作用而(er)形(xing)成(cheng)酶標抗體。也(ye)可(ke)先(xian)將(jiang)抗(kang)體與戊(wu)二quan作用，再(zai)與酶(mei)聯(lian)結(jie)。兩(liang)步法的產物中(zhong)絕(jue)大部(bu)分(fen)的酶與蛋白質是以1:1的比例結(jie)合(he)的，較(jiao)壹(yi)步法的酶結(jie)合(he)物更(geng)有(you)助於本(ben)底(di)的改善(shan)以提高(gao)敏感(gan)度(du)，但其(qi)偶(ou)聯(lian)的有(you)效(xiao)率(lv)較(jiao)壹(yi)步法低(di)。

　　2. 過(guo)碘(dian)suan鹽(yan)氧化(hua)法：本(ben)法只適(shi)用於(yu)含(han)糖量(liang)較(jiao)高(gao)的酶。辣根(gen)過氧(yang)化(hua)物酶的標記(ji)常(chang)用此(ci)法(fa)。反應(ying)時(shi)，過碘(dian)鈉將HRP分(fen)子表(biao)面(mian)的多(duo)糖氧化(hua)為(wei)醛(quan)基(ji)很活潑(po)，可(ke)與蛋白質上(shang)的氨基(ji)形成(cheng)Schiff氏堿而結(jie)合(he)。酶標記(ji)物按克分(fen)子比例聯(lian)結(jie)，其(qi)最佳(jia)比例為(wei)：酶/抗體=1-2/1。此法(fa)簡便(bian)有(you)效(xiao)，壹(yi)般(ban)認(ren)為(wei)是HRP可(ke)取(qu)的標記(ji)方(fang)法(fa)，但也(ye)有(you)人認(ren)為(wei)所(suo)有(you)試劑(ji)較(jiao)為(wei)強烈，各批實(shi)驗(yan)結(jie)果不易(yi)重(zhong)演(yan)。

　　按以上(shang)方(fang)法制(zhi)備的酶結(jie)合(he)物壹般(ban)都(dou)混有(you)未(wei)結(jie)合(he)物的酶和(he)抗(kang)體。理論上(shang)，結(jie)合(he)物中(zhong)混(hun)有(you)的遊離(li)酶壹般(ban)不影(ying)響(xiang)ELISA中(zhong)最(zui)後的酶活性(xing)測(ce)定，因(yin)經(jing)過*洗(xi)滌，遊離(li)酶可(ke)被(bei)除去，並(bing)不影(ying)響(xiang)最終(zhong)的顯色(se)。但遊離(li)的抗體則不同，它(ta)會(hui)與酶(mei)標(biao)抗體競(jing)爭相(xiang)應(ying)的固(gu)相(xiang)抗原(yuan)，從而(er)減(jian)少了結(jie)合(he)到固(gu)相(xiang)上(shang)的酶標(biao)抗(kang)體的量(liang)。因此制(zhi)備的酶結(jie)合(he)物應(ying)予(yu)純(chun)化(hua)，去除遊離(li)的酶和(he)抗(kang)體後用於(yu)檢(jian)測(ce)，效(xiao)果更(geng)好(hao)。純(chun)化(hua)的方法(fa)很(hen)多(duo)，分(fen)離(li)大分(fen)子化(hua)合(he)物的方法(fa)均可(ke)應(ying)用。硫(liu)酸銨(an)鹽(yan)析法簡便(bian)，但效(xiao)果並(bing)不理想(xiang)，因為(wei)此法只能(neng)去(qu)除留在(zai)上(shang)清(qing)中(zhong)的遊離(li)酶，但相(xiang)當數量(liang)的遊離(li)抗體仍(reng)與酶(mei)結(jie)合(he)物壹起沈(chen)澱(dian)而不能(neng)分(fen)開(kai)。用離(li)子交(jiao)換層(ceng)析或(huo)分(fen)子篩(shai)分(fen)離(li)更(geng)為(wei)可(ke)取(qu)，高(gao)效(xiao)液(ye)相(xiang)層(ceng)析法可(ke)將(jiang)制(zhi)備的結(jie)合(he)物清晰地分(fen)成(cheng)三個部分(fen)：遊離(li)酶、遊離(li)抗體和純(chun)結(jie)合(he)物而取得最(zui)佳(jia)的分(fen)離(li)效(xiao)果，但費(fei)用較(jiao)貴(gui)。

　　結(jie)合(he)物制(zhi)得後，在(zai)用作ELISA試(shi)劑前(qian)尚需(xu)確定(ding)其(qi)適(shi)當的工作濃(nong)度(du)。使用過(guo)濃(nong)的結(jie)合(he)物，既不經(jing)濟(ji)，又可(ke)使(shi)本(ben)底(di)增高(gao);結(jie)合(he)物的濃(nong)度(du)過低(di)，則又影(ying)響(xiang)檢(jian)測(ce)的敏感(gan)性(xing)。所(suo)以必須(xu)對(dui)結(jie)合(he)物的濃(nong)度(du)予以選(xuan)擇(ze)。最(zui)適(shi)的工作濃(nong)度(du)就是指結(jie)合(he)物稀釋至這(zhe)壹濃(nong)度(du)時(shi)，能(neng)維(wei)護壹(yi)個低的本(ben)底(di)，並(bing)獲得(de)測(ce)定的最佳(jia)靈(ling)敏(min)度(du)，達到合(he)適(shi)的測(ce)定條(tiao)件和測(ce)定費(fei)用的節省。就酶標(biao)抗(kang)體本(ben)身而言，它(ta)的有(you)效(xiao)工(gong)作濃(nong)度(du)是指與其(qi)相(xiang)應(ying)抗(kang)原(yuan)包被(bei)的載(zai)體作試(shi)驗(yan)時(shi)，能(neng)得(de)到陽性(xing)反應(ying)的*高(gao)稀釋度(du)。例如(ru)某(mou)壹HRP：抗(kang)人IgG制(zhi)劑標(biao)明的工作濃(nong)度(du)為(wei)1:5000，表(biao)示(shi)該制(zhi)劑經(jing)1:5000稀釋後，在(zai)與人(ren)IgG包(bao)被的固(gu)相(xiang)作ELISA試(shi)驗(yan)時(shi)，將發(fa)生(sheng)陽性(xing)反應(ying)。但在(zai)用於(yu)具(ju)體的ELISA檢(jian)測(ce)中(zhong)，酶(mei)標(biao)抗(kang)體的最適(shi)工(gong)作濃(nong)度(du)受到固(gu)相(xiang)載(zai)體的性(xing)質、包被抗(kang)原(yuan)或(huo)抗(kang)體的純(chun)度(du)以及(ji)整個檢(jian)測(ce)系(xi)統如(ru)標(biao)本(ben)、反應(ying)溫(wen)度(du)和時(shi)間(jian)等的影(ying)響(xiang)，因此(ci)必須(xu)在(zai)實際測(ce)定條(tiao)件下進(jin)行"滴配(pei)"選擇(ze)能(neng)達到高(gao)敏感(gan)度(du)的最大稀釋度(du)作為(wei)試劑盒中(zhong)的工作濃(nong)度(du)。

　　結(jie)合(he)物的保(bao)存(cun)

　　酶標(biao)抗(kang)體中(zhong)的酶和(he)抗(kang)體均為(wei)生(sheng)物活性(xing)物質，保(bao)存(cun)不當，極易(yi)失(shi)活。高(gao)濃(nong)度(du)的結(jie)合(he)物較(jiao)為(wei)穩(wen)定(ding)，冰(bing)凍幹燥(zao)後可(ke)在(zai)普通(tong)冰(bing)箱中(zhong)保(bao)存(cun)壹年(nian)左右，但凍(dong)幹過程(cheng)中(zhong)引(yin)起(qi)活力(li)的減(jian)低，而(er)且使用時(shi)需(xu)經(jing)復溶，頗為(wei)不便(bian)。結(jie)合(he)物溶液(ye)中(zhong)加(jia)入(ru)等體積(ji)的甘油(you)可(ke)在(zai)低溫(wen)冰(bing)箱或(huo)普通(tong)冰(bing)箱的冰(bing)格中(zhong)較(jiao)長時(shi)間(jian)保(bao)存(cun)。早(zao)期(qi)的ELISA試劑(ji)盒(he)中(zhong)的結(jie)合(he)物壹般(ban)均按以上(shang)兩(liang)種(zhong)形(xing)式(shi)供應(ying)，配(pei)以稀釋液(ye)(見(jian)3.2.5)臨(lin)用時(shi)按標明的稀釋度(du)稀釋成(cheng)工作液(ye)。現(xian)在(zai)較(jiao)*ELISA試(shi)劑(ji)盒(he)均已用合(he)適(shi)的緩(huan)沖液(ye)配(pei)成(cheng)工作液(ye)，使(shi)用時(shi)不需(xu)再(zai)行(xing)稀釋，在(zai)4-8℃保(bao)存(cun)期(qi)可(ke)達6個月。由於蛋白質濃(nong)度(du)較(jiao)低(di)，結(jie)合(he)物易(yi)失(shi)活，需(xu)加(jia)入(ru)蛋白保(bao)護劑(ji)。另(ling)外(wai)再(zai)加(jia)入(ru)抗(kang)生(sheng)素(例如(ru)慶(qing)大黴(mei)su)和(he)防(fang)腐劑(ji)(HRP結(jie)合(he)物加硫(liu)柳泵，AP結(jie)合(he)物可(ke)加(jia)疊(die)氮(dan)鈉)，以防(fang)止(zhi)細(xi)菌(jun)生(sheng)長。

　　結(jie)合(he)物的稀釋液(ye)

　　用於(yu)稀釋高(gao)濃(nong)度(du)的結(jie)合(he)物以配(pei)成(cheng)工作液(ye)。為(wei)避(bi)免(mian)結(jie)合(he)物在(zai)反應(ying)中(zhong)直(zhi)接(jie)吸(xi)附(fu)在(zai)固(gu)相(xiang)載(zai)體上(shang)，在(zai)稀釋緩(huan)沖液(ye)中(zhong)常(chang)加(jia)入(ru)高(gao)濃(nong)度(du)的無關(guan)蛋白質(例如(ru)1%牛(niu)血(xue)清白蛋白)，通(tong)過競(jing)爭以抑(yi)制(zhi)結(jie)合(he)物的吸附(fu)。壹(yi)般(ban)還(hai)加(jia)入(ru)具(ju)有(you)抑(yi)制(zhi)蛋白質吸附(fu)於(yu)塑(su)料表(biao)面(mian)的非離子型(xing)表(biao)面(mian)活性(xing)劑，如(ru)吐(tu)溫(wen)20，0.05%的濃(nong)度(du)較(jiao)為(wei)適(shi)宜(yi)。在(zai)間(jian)接(jie)測(ce)定抗(kang)體時(shi)，血(xue)清標(biao)本(ben)需(xu)稀釋後進(jin)行測(ce)定，也(ye)可(ke)應(ying)用這(zhe)種(zhong)稀釋液(ye)。

　　BUNSEN本(ben)生(sheng) 試劑(ji)盒組成(cheng)

　　標本(ben)要(yao)求

　　1. 標(biao)本(ben)采集(ji)後盡(jin)早(zao)進(jin)行提取，提取按相(xiang)關文(wen)獻(xian)進(jin)行，提取後應(ying)盡(jin)快(kuai)進(jin)行實驗(yan)。若不能(neng)馬(ma)上(shang)進(jin)行試驗(yan)，可(ke)將(jiang)標本(ben)放於(yu)-20℃保(bao)存(cun)，但應(ying)避(bi)免(mian)反復凍融

　　2. 不能(neng)檢(jian)測(ce)含NaN3的樣品(pin)，因(yin)NaN3抑(yi)制(zhi)辣根(gen)過氧(yang)化(hua)物酶的(HRP)活性(xing)。

　　操(cao)作步驟

　　1. 標準品(pin)的稀釋：本(ben)試劑盒(he)提供原(yuan)倍標準品(pin)壹(yi)支(zhi)，用戶(hu)可(ke)按照下列圖表(biao)在(zai)小試管中(zhong)進(jin)行稀釋。

　　2. 加樣(yang)

　　分(fen)別(bie)設(she)空(kong)白孔(空(kong)白對照(zhao)孔不加樣(yang)品(pin)及(ji)酶標(biao)試劑(ji)，其(qi)余各步操(cao)作相(xiang)同)、標(biao)準孔(kong)、待(dai)測(ce)樣品(pin)孔。在(zai)酶標包(bao)被板上(shang)標(biao)準品(pin)準確加(jia)樣50μl，待(dai)測(ce)樣品(pin)孔中(zhong)先(xian)加(jia)樣(yang)品(pin)稀釋液(ye)40μl，然(ran)後再(zai)加(jia)待(dai)測(ce)樣品(pin)10μl(樣品(pin)最終(zhong)稀釋度(du)為(wei)5倍)。加樣(yang)將(jiang)樣品加(jia)於酶(mei)標(biao)板孔(kong)底(di)部，盡(jin)量(liang)不觸(chu)及(ji)孔壁(bi)，輕(qing)輕(qing)晃動(dong)混勻。

　　3. 溫(wen)育：用封(feng)板膜(mo)封(feng)板後置37℃溫(wen)育30分(fen)鐘(zhong)。

　　4. 配(pei)液(ye)：將(jiang)20倍濃(nong)縮(suo)洗(xi)滌液(ye)用蒸(zheng)餾水20倍稀釋後備用

　　5. 洗(xi)滌：小心揭掉(diao)封(feng)板膜(mo)，棄(qi)去(qu)液(ye)體，甩(shuai)幹，每孔(kong)加滿(man)洗(xi)滌液(ye)，靜(jing)置(zhi)30秒(miao)後棄(qi)去(qu)，如(ru)此(ci)重(zhong)復5次(ci)，拍幹。

　　6. 加酶(mei)：每孔(kong)加(jia)入(ru)酶(mei)標試(shi)劑(ji)50μl，空(kong)白孔除外(wai)。

　　7. 溫(wen)育：操(cao)作同3。

　　8. 洗(xi)滌：操(cao)作同5。

　　9. 顯色(se)：每(mei)孔先(xian)加(jia)入(ru)顯色(se)劑(ji)A50μl，再(zai)加(jia)入(ru)顯色(se)劑(ji)B50μl，輕(qing)輕(qing)震蕩混勻，37℃避(bi)光(guang)顯色(se)15分(fen)鐘(zhong).

　　10. 終(zhong)止(zhi)：每(mei)孔(kong)加終(zhong)止(zhi)液(ye)50μl，終(zhong)止(zhi)反應(ying)(此(ci)時(shi)藍色(se)立(li)轉黃色(se))。

　　11. 測(ce)定：以空(kong)白空(kong)調(tiao)零，450nm波(bo)長依(yi)序(xu)測(ce)量(liang)各孔的吸光(guang)度(du)(OD值(zhi))。 測(ce)定應(ying)在(zai)加終(zhong)止(zhi)液(ye)後15分(fen)鐘(zhong)以內(nei)進(jin)行。

　　ELISA試劑盒操(cao)作程(cheng)序(xu)總結(jie)：

　　計算(suan)

　　以標(biao)準物的濃(nong)度(du)為(wei)橫(heng)坐(zuo)標，OD值(zhi)為(wei)縱坐標(biao)，在(zai)坐標紙(zhi)上(shang)繪出(chu)標(biao)準曲(qu)線(xian)，根(gen)據樣(yang)品(pin)的OD值(zhi)由標準曲(qu)線(xian)查(zha)出(chu)相(xiang)應(ying)的濃(nong)度(du);再(zai)乘以稀釋倍數;或(huo)用標(biao)準物的濃(nong)度(du)與OD值(zhi)計算(suan)出(chu)標(biao)準曲(qu)線(xian)的直線(xian)回歸(gui)方(fang)程(cheng)式(shi)，將樣(yang)品的OD值(zhi)代(dai)入(ru)方(fang)程式(shi)，計算(suan)出(chu)樣(yang)品濃(nong)度(du)，再(zai)乘以稀釋倍數，即(ji)為(wei)樣品的實際(ji)濃(nong)度(du)。

　　註意(yi)事項(xiang)

　　1. 試(shi)劑盒從冷(leng)藏(zang)環境中(zhong)取(qu)出(chu)應(ying)在(zai)室(shi)溫(wen)平(ping)衡15-30分(fen)鐘(zhong)後方可(ke)使(shi)用，酶(mei)標(biao)包(bao)被板開(kai)封(feng)後如(ru)未(wei)用完(wan)，板條(tiao)應(ying)裝入(ru)密(mi)封(feng)袋(dai)中(zhong)保(bao)存(cun)。

　　2. 濃(nong)洗(xi)滌液(ye)可(ke)能(neng)會(hui)有(you)結(jie)晶析出(chu)，稀釋時(shi)可(ke)在(zai)水浴(yu)中(zhong)加(jia)溫(wen)助溶，洗(xi)滌時(shi)不影(ying)響(xiang)結(jie)果。

　　3. 各步加樣(yang)均應(ying)使(shi)用加(jia)樣(yang)器(qi)，並(bing)經(jing)常(chang)校(xiao)對(dui)其(qi)準確性(xing)，以避(bi)免(mian)試驗(yan)誤(wu)差(cha)。壹次(ci)加樣(yang)時(shi)間(jian)最(zui)好(hao)控制(zhi)在(zai)5分(fen)鐘(zhong)內，如(ru)標(biao)本(ben)數量(liang)多(duo)，推(tui)薦(jian)使(shi)用排(pai)槍(qiang)加(jia)樣。

　　4. 請每次(ci)測(ce)定的同時(shi)做標準曲(qu)線(xian)，最(zui)好(hao)做復孔。如(ru)標(biao)本(ben)中(zhong)待(dai)測(ce)物質含量(liang)過高(gao)(樣本(ben)OD值(zhi)大於(yu)標(biao)準品(pin)孔(kong)第(di)壹孔(kong)的OD值(zhi))，請先(xian)用樣(yang)品(pin)稀釋液(ye)稀釋壹定(ding)倍數(n倍)後再(zai)測(ce)定，計算(suan)時(shi)請最後乘以總(zong)稀釋倍數(×n×5)。

　　5. 封(feng)板膜(mo)只(zhi)限(xian)壹(yi)次(ci)性(xing)使用，以避(bi)免(mian)交叉汙(wu)染。

　　6. 底(di)物請避(bi)光(guang)保(bao)存(cun)。

　　7. 嚴格(ge)按照說(shuo)明書的操(cao)作進(jin)行，試驗(yan)結(jie)果判定(ding)必須(xu)以酶(mei)標(biao)儀(yi)讀(du)數為(wei)準.

　　8. 所(suo)有(you)樣品(pin)，洗(xi)滌液(ye)和(he)各種(zhong)廢棄(qi)物都(dou)應(ying)按傳染物處理。

　　9. 本(ben)試劑不同批號(hao)組分(fen)不得混(hun)用。

　　洗(xi)滌液(ye)

　　在(zai)板式(shi)ELISA中(zhong)，常(chang)用的稀釋液(ye)為(wei)含0.05%吐溫(wen)20磷酸(suan)緩(huan)沖鹽(yan)水。

　　酶反應(ying)終(zhong)止(zhi)液(ye)

　　常(chang)用的HRP反應(ying)終(zhong)止(zhi)液(ye)為(wei)硫(liu)酸，其(qi)濃(nong)度(du)按加量(liang)及(ji)比色(se)液(ye)的最終(zhong)體積(ji)而異(yi)，在(zai)板式(shi)ELISA中(zhong)壹(yi)般(ban)采(cai)用2mol/L。

　　陽(yang)性(xing)對照(zhao)品(pin)和(he)陰性(xing)對照(zhao)品(pin)

　　陽(yang)性(xing)對照(zhao)品(pin)和(he)陰性(xing)對照(zhao)品(pin)是(shi)檢(jian)驗(yan)試(shi)驗(yan)有(you)效(xiao)性(xing)的控制(zhi)品，同時(shi)也(ye)作為(wei)判斷結(jie)果的對照(zhao)，因(yin)此(ci)對照(zhao)品(pin)，特別是(shi)陽(yang)性(xing)對照(zhao)品(pin)的基(ji)本(ben)組成(cheng)應(ying)盡(jin)量(liang)與檢(jian)測(ce)標本(ben)的組成(cheng)相(xiang)壹致(zhi)。以人(ren)血(xue)清為(wei)標本(ben)的測(ce)定，對(dui)照品(pin)最好(hao)也(ye)為(wei)人血(xue)清，因(yin)為(wei)正常(chang)人(ren)血(xue)清在(zai)各種(zhong)ELISA模(mo)式(shi)中(zhong)可(ke)產(chan)生(sheng)不同程(cheng)度(du)的本(ben)底(di)。由於大量(liang)正常(chang)人(ren)血(xue)甭(beng)較(jiao)難(nan)得(de)到，國外(wai)試(shi)劑盒中(zhong)的對照(zhao)品(pin)多(duo)以復鈣(gai)人血(xue)漿為(wei)原(yuan)料，即(ji)在(zai)血(xue)漿中(zhong)加(jia)入(ru)鈣(gai)離子，使(shi)其(qi)中(zhong)的纖維(wei)蛋白質凝固(gu)，除去凝塊後所(suo)得的液(ye)體，其(qi)組成(cheng)與血(xue)清相(xiang)似(si)。陰性(xing)對照(zhao)品(pin)須(xu)先(xian)行(xing)檢(jian)測(ce)，確定(ding)其(qi)中(zhong)不含待(dai)測(ce)物質。例如(ru)HBsAg檢(jian)測(ce)的陰性(xing)對照(zhao)品(pin)中(zhong)不可(ke)含(han)HBsAg，最好(hao)抗HBs也(ye)是(shi)陰性(xing)。陽性(xing)對照(zhao)品(pin)多(duo)以含(han)蛋白保(bao)護劑(ji)的緩(huan)沖液(ye)為(wei)基(ji)質，其(qi)中(zhong)加(jia)入(ru)壹(yi)定量(liang)的待(dai)檢(jian)物質，此量(liang)最好(hao)在(zai)試劑說(shuo)明書中(zhong)標(biao)明。加入(ru)的量(liang)應(ying)與試(shi)劑(ji)的敏感(gan)度(du)相(xiang)稱(cheng)，在(zai)測(ce)定中(zhong)得(de)到的吸光(guang)值(zhi)與受(shou)檢(jian)標(biao)本(ben)吸光值(zhi)比較(jiao)，可(ke)對(dui)標本(ben)中(zhong)受(shou)檢(jian)物質的量(liang)有(you)壹個粗略的估計。國外(wai)檢(jian)測(ce)HBsAg的ELISA試劑(ji)盒(he)檢(jian)測(ce)敏感(gan)度(du)約(yue)為(wei)0.5ng/ml，陽性(xing)對照(zhao)品(pin)中(zhong)含(han)量(liang)約(yue)為(wei)10ng/ml。在(zai)對照品(pin)中(zhong)壹(yi)般(ban)加(jia)入(ru)抗(kang)生(sheng)素和(he)防腐(fu)劑，以利(li)保(bao)存(cun)。

　　包被(bei)用抗(kang)體

　　包被(bei)固(gu)相(xiang)載(zai)體的抗體應(ying)具(ju)有(you)高(gao)親和(he)力和(he)高(gao)特異(yi)性(xing)，可(ke)取(qu)材(cai)於(yu)抗血(xue)清或(huo)含(han)單克(ke)隆(long)抗(kang)體的腹水或(huo)培(pei)養液(ye)。如(ru)免(mian)疫用抗(kang)原(yuan)中(zhong)含(han)有(you)雜質(即(ji)便(bian)是(shi)極微(wei)量(liang)的)，在(zai)抗血(xue)清中(zhong)將(jiang)出(chu)現(xian)雜(za)抗(kang)體，必須(xu)除去(可(ke)用吸(xi)收法)後才能(neng)用於(yu)ELISA，以保(bao)證(zheng)試驗(yan)的特異(yi)性(xing)。抗血(xue)清不能(neng)直(zhi)接(jie)用於(yu)包(bao)被(bei)，應(ying)先(xian)提取IgG，通(tong)常(chang)采(cai)用硫(liu)酸銨(an)鹽(yan)析和Sephadex凝膠(jiao)過(guo)濾法。壹(yi)般(ban)經(jing)硫(liu)酸銨(an)鹽(yan)析粗提的IgG已可(ke)用於(yu)包(bao)被(bei)，高(gao)度(du)純(chun)化(hua)的IgG性(xing)質不穩(wen)定(ding)。如(ru)需(xu)用高(gao)親和(he)力的抗體包被(bei)以提高(gao)試驗(yan)的敏感(gan)性(xing)，則可(ke)采(cai)用親(qin)和(he)層(ceng)析法以除去抗血(xue)清中(zhong)含(han)量(liang)較(jiao)多(duo)的非特異(yi)性(xing)IgG。腹水中(zhong)單抗(kang)的濃(nong)度(du)較(jiao)高(gao)，特異(yi)性(xing)亦(yi)較(jiao)強，因此不需(xu)要(yao)作吸(xi)收和親和層(ceng)析處理，壹般(ban)可(ke)將(jiang)腹水作適(shi)當稀釋後直接(jie)包(bao)被(bei)，必要(yao)時(shi)也(ye)可(ke)用純(chun)化(hua)的IgG。應(ying)用單抗(kang)包被(bei)時(shi)應(ying)註(zhu)意(yi)，壹種(zhong)單抗(kang)僅(jin)針(zhen)對(dui)壹(yi)種(zhong)抗(kang)原(yuan)決定(ding)簇，在(zai)某(mou)些(xie)情況(kuang)下，用多(duo)種(zhong)單抗(kang)混合(he)包被，可(ke)取(qu)得更(geng)好(hao)的效(xiao)果。

　　包被(bei)的條(tiao)件

　　包被(bei)用抗(kang)原(yuan)或(huo)抗(kang)體的濃(nong)度(du)，包被(bei)的溫(wen)度(du)和時(shi)間(jian)，包(bao)被(bei)液(ye)的pH等應(ying)根(gen)據試(shi)驗(yan)的特點(dian)和(he)材(cai)料的性(xing)質而選定(ding)。抗體和蛋白質抗原(yuan)壹般(ban)采(cai)用pH9.6的碳酸鹽(yan)緩(huan)沖液(ye)作為(wei)稀釋液(ye)，也(ye)有(you)用pH7.2的磷酸(suan)鹽(yan)緩(huan)沖液(ye)及(ji)pH7~8的Tris-HCL緩(huan)沖液(ye)作為(wei)稀釋液(ye)的。通(tong)常(chang)在(zai)ELISA板孔(kong)中(zhong)加(jia)入(ru)包(bao)被液(ye)後，在(zai)4-8℃冰(bing)箱中(zhong)放置(zhi)過(guo)夜，37℃中(zhong)保(bao)溫(wen)2小時(shi)被認(ren)為(wei)具有(you)同等的包被(bei)效(xiao)果。包被(bei)的濃(nong)度(du)隨載(zai)體和包(bao)被(bei)物的性(xing)質可(ke)有(you)很大的變化(hua)，每批材(cai)料需(xu)通(tong)過實(shi)驗(yan)與酶(mei)結(jie)合(he)物的濃(nong)度(du)協調(tiao)選定。壹(yi)般(ban)蛋白質的包被(bei)濃(nong)度(du)為(wei)100ng/ml-20ug/ml。

　　包被的方式(shi)

　　將抗(kang)原(yuan)或(huo)抗(kang)體固(gu)定在(zai)過程稱(cheng)為(wei)包被。換言之，包(bao)被即(ji)是抗(kang)原(yuan)或(huo)抗(kang)體結(jie)合(he)到固(gu)相(xiang)載(zai)體表(biao)面(mian)的過程(cheng)。蛋白質與聚(ju)苯乙(yi)xi固(gu)相(xiang)載(zai)體是通(tong)過物理吸附(fu)結(jie)合(he)的，靠的是蛋白質分(fen)子結(jie)構(gou)上(shang)的疏水基(ji)團與固(gu)相(xiang)載(zai)體表(biao)面(mian)的疏水基(ji)團間(jian)的作用於(yu)。這(zhe)種(zhong)物理吸附(fu)是(shi)非特異(yi)性(xing)的，受蛋白質的分(fen)子量(liang)、等電點(dian)、濃(nong)度(du)等的影(ying)響(xiang)。載(zai)體對不同蛋白質的吸附(fu)能(neng)力(li)是不相(xiang)同的，大分(fen)子蛋白質較(jiao)小分(fen)子蛋白質通(tong)常(chang)含(han)有(you)更(geng)多(duo)的疏水基(ji)團，故(gu)更(geng)易(yi)吸(xi)附(fu)到固(gu)相(xiang)載(zai)體表(biao)面(mian)。 IgG對聚(ju)苯乙(yi)xi等固(gu)相(xiang)具有(you)較(jiao)強的吸附(fu)力(li)，其(qi)聯(lian)結(jie)多(duo)發(fa)生(sheng)在(zai)Fc段上(shang)，抗(kang)體結(jie)合(he)點(dian)暴(bao)露(lu)於外(wai)，因(yin)此抗體的包被(bei)壹(yi)般(ban)均采用直(zhi)接(jie)吸(xi)附(fu)法(fa)。蛋白質抗原(yuan)大多(duo)也(ye)可(ke)采(cai)用與抗(kang)體相(xiang)似(si)的方法(fa)包(bao)被(bei)。當抗原(yuan)決定(ding)簇存(cun)在(zai)於或(huo)鄰(lin)近於疏水區域(yu)時(shi)，抗原(yuan)與固(gu)相(xiang)載(zai)體的直接(jie)吸(xi)附(fu)可(ke)使(shi)抗原(yuan)決定(ding)簇不能(neng)充分(fen)暴(bao)露(lu)，在(zai)這(zhe)種(zhong)情況(kuang)下，直(zhi)接(jie)包(bao)被(bei)效(xiao)果不佳，可(ke)以采(cai)用間(jian)接(jie)的捕獲(huo)包被(bei)法(fa)，即(ji)先(xian)將(jiang)針(zhen)對(dui)該抗原(yuan)的特異(yi)抗(kang)體作預包被，其(qi)後通(tong)過抗(kang)原(yuan)抗體反應(ying)使(shi)抗原(yuan)固(gu)相(xiang)化(hua)。此間(jian)接(jie)結(jie)合(he)在(zai)固(gu)相(xiang)上(shang)的抗原(yuan)遠離載(zai)體表(biao)面(mian)，其(qi)抗原(yuan)決定(ding)簇也(ye)得(de)以充分(fen)暴(bao)露(lu)。間(jian)接(jie)包(bao)被(bei)的抗原(yuan)經(jing)固(gu)相(xiang)抗體的親和(he)層(ceng)析作用，包(bao)被(bei)在(zai)固(gu)相(xiang)上(shang)的抗原(yuan)純(chun)度(du)大大提高(gao)，因此(ci)含雜(za)質較(jiao)多(duo)的抗原(yuan)也(ye)可(ke)采(cai)用捕獲(huo)包被(bei)法(fa)，試驗(yan)的特異(yi)性(xing)、敏感(gan)性(xing)均由此得(de)以改善(shan)，重(zhong)復性(xing)亦(yi)佳。間(jian)接(jie)包(bao)被(bei)的另(ling)壹優點(dian)是(shi)抗原(yuan)用量(liang)少，僅(jin)為(wei)直接(jie)包(bao)被(bei)的1/10乃至於(yu)/100。不易(yi)吸(xi)附(fu)在(zai)聚(ju)苯乙(yi)xi載(zai)體上(shang)的非蛋白質抗原(yuan)可(ke)采(cai)用特(te)殊(shu)的包被(bei)方(fang)式(shi)。例如(ru)，在(zai)檢(jian)測(ce)抗DNA抗(kang)體時(shi)，需(xu)用DNA作為(wei)包被抗原(yuan)，而普遍的固(gu)相(xiang)載(zai)體壹般(ban)不能(neng)直(zhi)接(jie)與核酸結(jie)合(he)。可(ke)將(jiang)聚(ju)苯乙(yi)xi板先(xian)經(jing)紫外(wai)線(xian)照射，以增加(jia)其(qi)吸附(fu)性(xing)能(neng)。固(gu)相(xiang)載(zai)體先(xian)用堿(jian)性(xing)蛋白質，如(ru)聚(ju)賴(lai)氨(an)酸(suan)、魚(yu)精蛋bai等作預包被，也(ye)可(ke)提高(gao)核酸的結(jie)合(he)力。也(ye)可(ke)用親(qin)和(he)素(su)生(sheng)物su系(xi)統作間(jian)接(jie)包(bao)被(bei)，即(ji)用親(qin)和(he)素(su)先(xian)包(bao)被(bei)載(zai)體，然(ran)後加入(ru)生(sheng)物su化(hua)的DNA，這(zhe)種(zhong)包(bao)被(bei)方(fang)法(fa)均勻、牢固(gu)，已擴(kuo)大應(ying)用於(yu)各種(zhong)抗(kang)原(yuan)物質的定量(liang)測(ce)定。

　　脂類物質無法與固(gu)相(xiang)載(zai)體結(jie)合(he)，可(ke)將(jiang)其(qi)在(zai)有(you)機溶(rong)劑(ji)中(zhong)溶(rong)解(jie)後加入(ru)ELISA板孔(kong)中(zhong)，開(kai)蓋(gai)置(zhi)冰(bing)箱過(guo)夜或(huo)冷(leng)風吹幹，待(dai)酒(jiu)精揮發(fa)後，讓脂質自然(ran)幹固(gu)在(zai)固(gu)相(xiang)表(biao)面(mian)。抗心磷脂抗體的ELISA試劑(ji)壹(yi)般(ban)采(cai)用這(zhe)種(zhong)包(bao)被(bei)方(fang)式(shi)。

　　洗(xi)板方(fang)法(fa)：

　　1. 手(shou)工洗(xi)板方(fang)法(fa)：吸(xi)去(qu)或(huo)甩(shuai)掉(diao)酶標(biao)板內(nei)的液(ye)體;在(zai)實驗(yan)臺(tai)上(shang)鋪墊幾層(ceng)吸(xi)水紙，酶(mei)標(biao)板朝(chao)下用力(li)拍(pai)幾次(ci);將推(tui)薦(jian)的洗(xi)滌緩(huan)沖液(ye)至少0.3ml註(zhu)入(ru)孔(kong)內，浸(jin)泡1-2分(fen)鐘(zhong)，根(gen)據需(xu)要(yao)，重(zhong)復此過程(cheng)數次(ci)。

　　2. 自動(dong)洗(xi)板：如(ru)果有(you)自動(dong)洗(xi)板機，應(ying)在(zai)熟練(lian)使(shi)用後再(zai)用到正式(shi)實驗(yan)過(guo)程中(zhong)。待(dai)檢(jian)樣(yang)本(ben)：體液(ye)、血(xue)清、血(xue)漿、細胞培養上(shang)清(qing)液(ye)、尿液(ye)、組織(zhi)勻漿、心房水標本(ben)等 既能(neng)滿(man)足(zu)研發類(lei)客(ke)戶(hu)對(dui)產品(pin)種(zhong)類(lei)、包(bao)裝的特殊(shu)要(yao)求，也(ye)能(neng)滿(man)足(zu)生(sheng)產型(xing)企業(ye)從小試、中(zhong)試(shi)到規模(mo)化(hua)生(sheng)產各個階段的綜合(he)需(xu)求(qiu)。產品(pin)涵蓋(gai)有(you)熒(ying)光定量(liang)PCR耗(hao)材(cai)(八(ba)聯(lian)管,單管(guan),96孔板,384孔(kong)板,封(feng)板膜(mo),輔(fu)助器(qi)等)，ELISA試劑盒，移(yi)液(ye)器(qi)吸(xi)嘴(zui)，離(li)心管，凍存(cun)管，培(pei)養皿，培(pei)養板，培(pei)養瓶，吸頭(tou)，儀(yi)器(qi)及(ji)手(shou)套(tao)，培(pei)養基(ji)，抗體，血(xue)清，色(se)譜(pu)耗(hao)材(cai)，針(zhen)頭(tou)過(guo)濾器(qi)及(ji)實驗(yan)室(shi)常(chang)用耗(hao)材(cai)。

　　如(ru)何正確檢(jian)測(ce)ELISA試劑(ji)盒，有(you)什麽方法？ 本(ben)生(sheng)既能(neng)滿(man)足(zu)研發類(lei)客(ke)戶(hu)對(dui)產品(pin)種(zhong)類(lei)、包(bao)裝的特殊(shu)要(yao)求，也(ye)能(neng)滿(man)足(zu)生(sheng)產型(xing)企業(ye)從小試、中(zhong)試(shi)到規模(mo)化(hua)生(sheng)產各個階段的綜合(he)需(xu)求(qiu)。產品(pin)涵蓋(gai)有(you)熒(ying)光定量(liang)PCR耗(hao)材(cai)(八(ba)聯(lian)管,單管(guan),96孔板,384孔(kong)板,封(feng)板膜(mo),輔(fu)助器(qi)等)，ELISA試劑盒，移(yi)液(ye)器(qi)吸(xi)嘴(zui)，離(li)心管，凍存(cun)管，培(pei)養皿，培(pei)養板，培(pei)養瓶，吸頭(tou)，儀(yi)器(qi)及(ji)手(shou)套(tao)，培(pei)養基(ji)，抗體，血(xue)清，色(se)譜(pu)耗(hao)材(cai)，針(zhen)頭(tou)過(guo)濾器(qi)及(ji)實驗(yan)室(shi)常(chang)用耗(hao)材(cai)。