ELISA各(ge)個操(cao)作步驟的註(zhu)意(yi)要點，珠式、管(guan)式及(ji)磁(ci)性球(qiu)ELSIA，國外(wai)試(shi)劑(ji)均與特殊儀(yi)器配(pei)合(he)應用(yong)，兩者均(jun)有詳(xiang)細(xi)的使(shi)用說明(ming)，嚴(yan)格(ge)遵(zun)照(zhao)規定操(cao)作，必能(neng)得(de)出準(zhun)確的結(jie)果。

　　壹、標本(ben)的采(cai)取(qu)和保存

　　可(ke)用作ELISA測(ce)定的標(biao)本(ben)十分廣(guang)泛，體(ti)液(如血清)、分泌物(wu)(唾(tuo)液)和(he)排(pai)泄(xie)物(wu)(如尿液(ye)、糞便)等均可(ke)作標本(ben)以(yi)測(ce)定其中某種(zhong)抗體(ti)或抗原(yuan)成份(fen)。有些(xie)標(biao)本(ben)可(ke)直接(jie)進行(xing)測(ce)定(如血清、尿液(ye))，有(you)些(xie)則(ze)需(xu)經預(yu)處(chu)理(li)(如糞便和某些(xie)分泌物(wu))。大(da)部(bu)分ELISA檢測(ce)均(jun)以(yi)血清為(wei)標本(ben)。血漿中除尚(shang)含有纖(xian)維(wei)蛋白原(yuan)和抗(kang)凝(ning)劑(ji)外，其他成份(fen)均同(tong)等於血清。制(zhi)備血漿標(biao)本(ben)需(xu)借(jie)助(zhu)於(yu)抗凝(ning)劑(ji)，而血清標(biao)本(ben)只(zhi)要待(dai)血清自(zi)然凝(ning)固(gu)、收(shou)縮後(hou)即(ji)可(ke)取(qu)得(de)。除特殊情況(kuang)外(wai)，在(zai)醫(yi)學檢驗(yan)中均(jun)以(yi)血清作為(wei)檢測(ce)標(biao)本(ben)。在(zai)ELISA中血漿和(he)血清可(ke)同等應用(yong)。血清標(biao)本(ben)可(ke)按常(chang)規(gui)方(fang)法(fa)采集，應註(zhu)意(yi)避(bi)免溶(rong)血，紅細(xi)胞(bao)溶(rong)解時會釋放(fang)出(chu)具有(you)過(guo)氧化(hua)物(wu)酶活(huo)性的物(wu)質，以(yi)HRP為(wei)標記(ji)的ELISA測(ce)定中，溶(rong)血標本(ben)可(ke)能會增加(jia)非(fei)特異(yi)性顯色。

　　血清標(biao)本(ben)宜(yi)在(zai)新鮮(xian)時檢測(ce)。如有細(xi)菌(jun)汙(wu)染，菌體(ti)中可(ke)能含有內源(yuan)性(xing)HRP，也(ye)會產生(sheng)假陽(yang)性反(fan)應。如在(zai)冰(bing)箱中保(bao)存過久，其中的可(ke)發(fa)生(sheng)聚(ju)合(he)，在(zai)間接(jie)法(fa)ELISA中可(ke)使(shi)本(ben)底加深。壹般(ban)說(shuo)來(lai)，在(zai)5天內測(ce)定的血清標(biao)本(ben)可(ke)放置於(yu)4℃，超過(guo)壹周測(ce)定的需(xu)低(di)溫冰(bing)存。凍(dong)結血清融(rong)解(jie)後(hou)，蛋(dan)白質(zhi)局(ju)部(bu)濃(nong)縮，分布不均(jun)，應充分混勻宜(yi)輕緩(huan)，避(bi)免氣(qi)泡，可(ke)上下(xia)顛倒混和，不要在(zai)混勻器上強(qiang)烈振(zhen)蕩(dang)。混濁或有沈澱(dian)的血清標(biao)本(ben)應先離(li)心(xin)或過濾，澄(cheng)清(qing)後(hou)再檢測(ce)。反(fan)復(fu)凍(dong)融會使(shi)抗體效(xiao)價(jia)跌落，所(suo)以(yi)測(ce)抗(kang)體(ti)的血清標(biao)本(ben)如需(xu)保(bao)存作多次(ci)檢測(ce)，宜(yi)少(shao)量(liang)分裝冰(bing)存。保存血清自(zi)采集時就應註(zhu)意(yi)無菌操(cao)作，也(ye)可(ke)加入(ru)適(shi)當(dang)防腐劑(ji)。

　　二(er)、試劑(ji)的準(zhun)備

　　按試(shi)劑(ji)盒說明(ming)書(shu)的要求準備實(shi)驗(yan)中需(xu)用(yong)的試(shi)劑(ji)。ELISA中用(yong)的蒸(zheng)餾(liu)水(shui)或去(qu)離(li)子(zi)水(shui)，包括(kuo)用(yong)於(yu)洗滌的，應為(wei)新鮮(xian)的和(he)高(gao)質量(liang)的。自(zi)配(pei)的緩(huan)沖(chong)液應用(yong)pH計(ji)測(ce)量(liang)較(jiao)正(zheng)。從(cong)冰(bing)箱中取(qu)出的試(shi)驗(yan)用試劑(ji)應待(dai)溫度與室溫平衡(heng)後(hou)使(shi)用。試劑(ji)盒中本(ben)次(ci)試(shi)驗(yan)不需(xu)用(yong)的部(bu)分應及(ji)時放回冰(bing)箱保存。

　　三(san)、加樣(yang)

　　在(zai)ELISA中壹般(ban)有(you)3次(ci)加(jia)樣步聚(ju)，即(ji)加(jia)標本(ben)，加(jia)酶(mei)結(jie)合(he)物(wu)，加底物(wu)。加樣(yang)時應將(jiang)所加(jia)物(wu)加在(zai)LEISA板孔的底部(bu)，避免加(jia)在(zai)孔壁上部(bu)，並(bing)註(zhu)意(yi)不可(ke)濺(jian)出，不可(ke)產生(sheng)氣泡(pao)。加標本(ben)壹般(ban)用(yong)微量加(jia)樣(yang)器，按規(gui)定的量(liang)加(jia)入(ru)板(ban)孔(kong)中。每(mei)次(ci)加(jia)標本(ben)應更(geng)換吸(xi)嘴，以(yi)免發(fa)生(sheng)交(jiao)叉汙染，也(ye)可(ke)用壹次(ci)性(xing)的定量塑(su)料管(guan)加樣(yang)。有此測(ce)定(如間接(jie)法(fa)ELISA)需(xu)用(yong)稀(xi)釋(shi)的血清，可(ke)在(zai)試管(guan)中按規(gui)定的稀(xi)釋(shi)度(du)稀(xi)釋後(hou)再加(jia)樣。也(ye)可(ke)在(zai)板孔中加(jia)入(ru)稀(xi)釋(shi)液，再在(zai)其中加(jia)入(ru)血清標(biao)本(ben)，然(ran)後(hou)在(zai)微型震(zhen)蕩(dang)器上震(zhen)蕩(dang)1分鐘(zhong)以(yi)混和。加(jia)酶(mei)結合(he)物(wu)應用(yong)液和(he)底物(wu)應用(yong)液時可(ke)用定量多(duo)道加(jia)液(ye)器，使(shi)加液過(guo)程迅速(su)完(wan)成。

　　四、保溫

　　在(zai)ELISA中壹般(ban)有(you)兩次(ci)抗(kang)原(yuan)抗體(ti)反(fan)應，即(ji)加標(biao)本(ben)和(he)加(jia)酶(mei)結合(he)物(wu)後(hou)。抗(kang)原(yuan)抗體(ti)反(fan)應的完(wan)成需(xu)要有壹定的溫度和時間，這壹保溫過程稱為(wei)溫育(yu)(incubation)，有人稱之為(wei)孵育(yu)，在(zai)ELISA中似(si)不恰(qia)當(dang)。

　　ELISA屬(shu)固(gu)相免疫(yi)測(ce)定，抗原(yuan)、抗體(ti)的結(jie)合(he)只在(zai)固(gu)相表(biao)面上(shang)發(fa)生(sheng)。以(yi)抗(kang)體包被的夾心(xin)法(fa)為(wei)例，加(jia)入(ru)板(ban)孔(kong)中的標(biao)本(ben)，其(qi)中的抗(kang)原(yuan)並(bing)不是(shi)都有均(jun)等的和(he)固(gu)相抗(kang)結合(he)的機(ji)會，只有(you)貼(tie)近(jin)孔壁的壹層(ceng)溶(rong)液中的抗(kang)原(yuan)直接(jie)與抗體接(jie)觸(chu)。這是(shi)壹個逐(zhu)步平(ping)衡(heng)的過(guo)程，因此(ci)需(xu)經擴散(san)才(cai)能(neng)達到反(fan)應的終(zhong)點(dian)。在(zai)其後(hou)加(jia)入(ru)的酶(mei)標(biao)記(ji)抗(kang)體與固(gu)相抗(kang)原(yuan)的結(jie)合(he)也(ye)同樣如此。這就是(shi)為(wei)什麽ELISA反(fan)應總(zong)是需(xu)要壹定時間的溫育(yu)。

　　溫育(yu)常(chang)采(cai)用(yong)的溫度有43℃、37℃、室(shi)溫和4℃(冰(bing)箱溫度)等。37℃是實(shi)驗(yan)室中常(chang)用(yong)的保(bao)溫溫度，也(ye)是大(da)多數(shu)抗(kang)原(yuan)抗體(ti)結合(he)的合(he)適(shi)溫度。在(zai)建立ELISA方(fang)法(fa)作反(fan)應動(dong)力學研(yan)究(jiu)時，實(shi)驗(yan)表明，兩次(ci)抗(kang)原(yuan)抗體(ti)反(fan)應壹般(ban)在(zai)37℃經1-2小時，產物(wu)的生(sheng)成可(ke)達。為(wei)加速(su)反(fan)應，可(ke)提(ti)高(gao)反(fan)應的溫度，有些(xie)試(shi)驗(yan)在(zai)43℃進行(xing)，但不宜(yi)采(cai)用(yong)更(geng)高(gao)的溫度。抗原(yuan)抗體(ti)反(fan)應4℃更(geng)為(wei)，在(zai)放射免疫(yi)測(ce)定中多(duo)使(shi)反(fan)應在(zai)冰(bing)箱中過(guo)夜，以(yi)形成多的沈(chen)澱(dian)。但因所(suo)需(xu)時間太長(chang)，在(zai)ELISA中壹般(ban)不予(yu)采(cai)用(yong)。

　　保(bao)溫的方(fang)式除有(you)的ELISA儀(yi)器附有特制的電(dian)熱(re)塊(kuai)外(wai)，壹般(ban)均(jun)采用水(shui)浴，可(ke)將ELISA板(ban)置於(yu)水(shui)浴箱中，ELISA板(ban)底應貼(tie)著(zhe)水(shui)面，使(shi)溫度迅速(su)平(ping)衡(heng)。為(wei)避免蒸(zheng)發(fa)，板上應加(jia)蓋(gai)，也(ye)可(ke)用塑(su)料貼(tie)封紙(zhi)或保鮮膜覆(fu)蓋(gai)板(ban)孔，此時可(ke)讓(rang)反(fan)應板(ban)漂浮(fu)在(zai)水(shui)面上(shang)。若(ruo)用保(bao)溫箱，ELISA板應放(fang)在(zai)濕(shi)盒內，濕(shi)盒要選用(yong)傳熱性(xing)良好(hao)的材(cai)料如金(jin)屬(shu)等，在(zai)盒底墊(dian)濕(shi)的紗(sha)布，將(jiang)ELISA板(ban)放在(zai)濕(shi)紗(sha)布上(shang)。濕(shi)盒應先放(fang)在(zai)保溫箱中預(yu)溫至規定的溫度，特別(bie)是(shi)在(zai)氣溫較低的時候更(geng)應如此。無論是水(shui)浴還(hai)是濕(shi)盒溫育(yu)，反(fan)應板(ban)均不宜(yi)疊(die)放(fang)，以(yi)各(ge)板的溫度都能迅速(su)平(ping)衡(heng)。室溫溫育(yu)的反(fan)應，操(cao)作時的室(shi)溫應嚴(yan)格限(xian)制在(zai)規定的範(fan)圍內，標(biao)準(zhun)室溫溫度是指(zhi)20-25℃，但具體操(cao)作時可(ke)根據(ju)說(shuo)明(ming)書的要求控(kong)制溫育(yu)。室溫溫育(yu)時，ELISA板只要平置於(yu)操(cao)作臺上(shang)即(ji)可(ke)。應註(zhu)意(yi)溫育(yu)的溫度和時間應按規(gui)定力求準確(que)。為(wei)這壹點，壹個人操(cao)作時，壹次(ci)不宜(yi)多(duo)於(yu)兩塊板(ban)同時測(ce)定。