大(da)鼠凝(ning)血(xue)因(yin)子(zi)Xa(FXa)elisa試劑(ji)盒(he)技術(shu)原理

　　試(shi)驗原理：

　　大(da)鼠凝(ning)血(xue)因(yin)子(zi)Xa(FXa)是固相夾心法(fa)酶(mei)聯免(mian)疫吸附實驗(yan)(ELISA).已知待(dai)測物質(zhi)濃度的(de)標準(zhun)品、未(wei)知濃(nong)度的(de)樣品(pin)加入(ru)微(wei)孔酶標板(ban)內(nei)進行檢測(ce)。先將待(dai)測物質(zhi)和生物素(su)標記(ji)的(de)抗體(ti)同(tong)時(shi)溫育(yu)。洗滌後，加入(ru)親和素(su)標記(ji)過(guo)的(de)HRP。再(zai)經(jing)過(guo)溫育(yu)和洗滌，去除(chu)未結(jie)合的(de)酶(mei)結(jie)合物，然後加入(ru)底(di)物A、B，和酶結(jie)合物同時(shi)作(zuo)用(yong)。產生(sheng)顏色(se)。顏色(se)的(de)深(shen)淺和樣品(pin)中待(dai)測物質(zhi)的(de)濃(nong)度呈(cheng)比例(li)關(guan)系(xi)。

　　內(nei)容(rong)及其(qi)配制(zhi)

　　自(zi)備(bei)材料(liao)

　　1)蒸(zheng)餾水(shui)。

　　2)加(jia)樣器(qi)：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

　　3)大(da)鼠凝(ning)血(xue)因(yin)子(zi)Xa(FXa)ELISA試劑(ji)盒(he)振(zhen)蕩(dang)器(qi)及(ji)磁力攪(jiao)拌(ban)器(qi)等。

　　安全(quan)性

　　1)避免(mian)直(zhi)接(jie)接(jie)觸(chu)終止液(ye)和底(di)物A、B。壹旦(dan)接(jie)觸(chu)到(dao)這(zhe)些液(ye)體，請盡快(kuai)用(yong)水沖洗。

　　2)實驗(yan)中(zhong)不要吃喝(he)、抽煙或使用(yong)化妝(zhuang)品(pin)。

　　3)不(bu)要用(yong)嘴吸取試劑盒(he)裏(li)的(de)任(ren)何(he)成(cheng)份(fen)。

　　操(cao)作(zuo)註(zhu)意(yi)事項

　　1)試(shi)劑應按標簽說明(ming)書(shu)儲存(cun)，使用(yong)前恢復到(dao)室(shi)溫。稀稀過後的(de)標準(zhun)品應丟(diu)棄，不(bu)可保(bao)存(cun)。

　　2)實驗(yan)中(zhong)不用(yong)的(de)板(ban)條(tiao)應立(li)即(ji)放(fang)回(hui)包(bao)裝袋(dai)中(zhong)，密(mi)封保存，以免(mian)變質(zhi)。

　　3)不用(yong)的(de)其(qi)它(ta)試(shi)劑應包(bao)裝好或蓋好。不(bu)同(tong)批號的(de)試(shi)劑(ji)不(bu)要混用(yong)。保質(zhi)前使用(yong)。

　　4)使用(yong)壹次性的(de)吸頭(tou)以免(mian)交叉(cha)汙(wu)染(ran)，吸取終止液(ye)和底(di)物A、B液(ye)時(shi)，避免(mian)使用(yong)帶(dai)金屬(shu)部分的(de)加(jia)樣器(qi)。

　　5)使用(yong)幹(gan)凈(jing)的(de)塑(su)料(liao)容(rong)器(qi)配(pei)置洗滌液(ye)。使用(yong)前充(chong)分混勻(yun)試(shi)劑盒(he)裏(li)的(de)各(ge)種成份(fen)及樣品(pin)。

　　6)洗滌酶標板(ban)時(shi)應充(chong)分拍(pai)幹(gan)，不要將吸水(shui)紙(zhi)直(zhi)接(jie)放(fang)入(ru)酶(mei)標反應孔(kong)中(zhong)吸水(shui)。

　　7)底(di)物A應揮(hui)發，避(bi)免(mian)長時(shi)間打開蓋(gai)子(zi)。底(di)物B對(dui)光(guang)敏感，避免(mian)長時(shi)間暴露(lu)於(yu)光下。避免(mian)用(yong)手接(jie)觸(chu)，有毒(du)。實驗(yan)完(wan)成後應立(li)即(ji)讀(du)取OD值。

　　8)加入(ru)試(shi)劑的(de)順(shun)序(xu)應壹致，以保(bao)證(zheng)所(suo)有反應板(ban)孔溫育(yu)的(de)時(shi)間壹樣。

　　9)按照(zhao)說明(ming)書(shu)中標明(ming)的(de)時(shi)間、加液(ye)的(de)量及(ji)順(shun)序(xu)進(jin)行(xing)溫育(yu)操(cao)作(zuo)。

　　樣品(pin)收(shou)集(ji)、處(chu)理(li)及保(bao)存方(fang)法(fa)

　　1)血(xue)清(qing)-----操(cao)作(zuo)過(guo)程(cheng)中(zhong)避免(mian)任(ren)何(he)細胞刺激。使用(yong)不含(han)熱(re)原和內(nei)毒素(su)的(de)試(shi)管(guan)。收(shou)集(ji)血(xue)液(ye)後，1000×g離心10分鐘將血(xue)清(qing)和紅(hong)細胞迅速(su)小(xiao)心地分離。

　　2)血(xue)漿-----EDTA、檸(ning)檬酸鹽、肝(gan)素(su)血(xue)漿可用(yong)於(yu)檢測(ce)。1000×g離心30分鐘去(qu)除顆(ke)粒(li)。

　　3)細胞上(shang)清(qing)液(ye)---1000×g離心10分鐘去(qu)除顆(ke)粒(li)和聚合物。

　　4)組(zu)織(zhi)勻(yun)漿-----將組(zu)織(zhi)加入(ru)適(shi)量生(sheng)理(li)鹽水搗(dao)碎。1000×g離心10分鐘，取上(shang)清(qing)液(ye)

　　5)保存------如果樣品(pin)不立(li)即(ji)使用(yong)，大(da)鼠凝(ning)血(xue)因(yin)子(zi)Xa(FXa)ELISA試劑(ji)盒(he)應將其(qi)分成(cheng)小(xiao)部(bu)分-70 ℃保(bao)存(cun)，避(bi)免(mian)反復冷凍。盡(jin)可能(neng)的(de)不(bu)要使用(yong)溶血(xue)或高血(xue)脂(zhi)血(xue)。如(ru)果血(xue)清(qing)中(zhong)大(da)量顆(ke)粒(li)，檢測(ce)前先離心或過濾。不要在37℃或更(geng)高(gao)的(de)溫度加(jia)熱(re)解(jie)凍。應在(zai)室(shi)溫下解(jie)凍並確保(bao)樣品(pin)均(jun)勻(yun)地充(chong)分解(jie)凍。

　　試劑的(de)準(zhun)備(bei):

　　1)標準(zhun)品：標準(zhun)品的(de)系(xi)列(lie)稀釋應在(zai)實驗(yan)時(shi)準備(bei)，不能儲(chu)存。稀釋前將標準(zhun)品振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)。

　　2)洗滌緩沖液(ye)(50×)的(de)稀釋：蒸(zheng)餾水(shui)50倍稀釋。

　　操(cao)作(zuo)步(bu)驟:

　　1)使用(yong)前，將所(suo)有試(shi)劑(ji)充(chong)分混勻(yun)。不(bu)要使液(ye)體產生大(da)量的(de)泡沫，以免(mian)加樣時(shi)加入(ru)大(da)量的(de)氣(qi)泡，產(chan)生(sheng)加(jia)樣上(shang)的(de)誤(wu)差(cha)。

　　2)根據待(dai)測樣品(pin)數量加(jia)上(shang)標準(zhun)品的(de)數(shu)量決(jue)定(ding)所(suo)需(xu)的(de)板(ban)條(tiao)數(shu)。每(mei)個(ge)標準(zhun)品和空白孔建(jian)議(yi)做(zuo)復孔(kong)。每個樣品(pin)根據自(zi)己的(de)數(shu)量來定，能使用(yong)復孔(kong)的(de)盡(jin)量做(zuo)復(fu)孔。標本(ben)用(yong)標本(ben)稀釋液(ye)1：1稀釋後加入(ru)50ul於(yu)反應孔(kong)內(nei)。

　　3)加入(ru)稀釋好後的(de)標準(zhun)品50ul於(yu)反應孔(kong)、加(jia)入(ru)待(dai)測樣品(pin)50ul於(yu)反應孔(kong)內(nei)。立即(ji)加(jia)入(ru)50ul的(de)生(sheng)物素(su)標記(ji)的(de)抗體(ti)。蓋(gai)上(shang)膜(mo)板(ban)，輕輕振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)，37℃溫育(yu)1小(xiao)時(shi)。

　　4)甩去(qu)孔內(nei)液(ye)體，每孔加滿洗滌液(ye)，振(zhen)蕩(dang)30秒(miao)，甩去(qu)洗滌液(ye)，用(yong)吸水(shui)紙(zhi)拍(pai)幹(gan)。重(zhong)復(fu)此(ci)操(cao)作(zuo)3次(ci)。如(ru)果用(yong)洗板(ban)機洗滌，洗滌次數(shu)增(zeng)加壹次。

　　5)每孔加入(ru)80ul的(de)親和鏈(lian)酶素(su)-HRP，輕輕振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)，37℃溫育(yu)30分鐘。

　　6)甩去(qu)孔內(nei)液(ye)體，每孔加滿洗滌液(ye)，振(zhen)蕩(dang)30秒(miao)，甩去(qu)洗滌液(ye)，用(yong)吸水(shui)紙(zhi)拍(pai)幹(gan)。重(zhong)復(fu)此(ci)操(cao)作(zuo)3次(ci)。如(ru)果用(yong)洗板(ban)機洗滌，洗滌次數(shu)增(zeng)加壹次。

　　7)每孔加入(ru)底(di)物A、B各(ge)50ul，輕輕振(zhen)蕩(dang)混勻(yun)，37℃溫育(yu)10分鐘。避(bi)免(mian)光照(zhao)。

　　8)取出酶標板(ban)，迅速(su)加(jia)入(ru)50ul終止液(ye)，加入(ru)終止液(ye)後應立(li)即(ji)測(ce)定(ding)結(jie)果。

　　9)在(zai)450nm波長處(chu)測定各(ge)孔(kong)的(de)OD值(zhi)。

　　局(ju)限(xian):

　　6號標準(zhun)品以上(shang)的(de)結(jie)果為非線(xian)性的(de)，根據此標準(zhun)曲(qu)線(xian)無(wu)法(fa)得(de)到精(jing)確的(de)結(jie)果。

　　大(da)鼠凝(ning)血(xue)因(yin)子(zi)Xa(FXa)ELISA試劑(ji)盒(he)性能

　　1. 靈(ling)敏度：最小(xiao)的(de)檢(jian)測(ce)濃(nong)度小(xiao)於(yu)1號標準(zhun)品。稀釋度的(de)線(xian)性。樣品(pin)線(xian)性回歸與預期(qi)濃(nong)度相關系(xi)數R值(zhi)為0.990。

　　2. 特異性：不與其(qi)它(ta)細胞因(yin)子(zi)反應。

　　3. 重(zhong)復(fu)性：板(ban)內(nei)、板(ban)間變異系(xi)數(shu)均(jun)小(xiao)於(yu)10%。

　　結(jie)果判斷與分析(xi)

　　1、儀器(qi)值(zhi)：於(yu)波長450nm的(de)酶(mei)標儀(yi)上(shang)讀(du)取各(ge)孔(kong)的(de)OD值(zhi)

　　2、以吸光(guang)度OD值(zhi)為縱坐標(Y)，相應的(de)待(dai)測物質(zhi)標準(zhun)品濃(nong)度為橫坐(zuo)標(X)，做(zuo)得(de)相應的(de)曲(qu)線(xian)，樣品(pin)的(de)待(dai)測物質(zhi)含量可根據其(qi)OD值由(you)標準(zhun)曲(qu)線(xian)換(huan)算出相應的(de)濃(nong)度。