所(suo)謂實時(shi)熒光(guang)定量PCR技(ji)術(shu) ，是(shi)指(zhi)在(zai)PCR反應(ying)體系(xi)中加(jia)入(ru)熒光(guang)基(ji)團(tuan)，利(li)用(yong)熒光(guang)信(xin)號積累(lei)實時(shi)監測(ce)整個(ge)PCR進程，後(hou)通過(guo)標準曲線對(dui)未(wei)知(zhi)模(mo)板(ban)進行(xing)定量分(fen)析(xi)的(de)方(fang)法。以下便(bian)是天(tian)津本生生(sheng)物(wu)就熒光(guang)定量PCR原理(li)的(de)簡(jian)要說(shuo)明(ming)，壹起(qi)來(lai)看(kan)下：

　　檢(jian)測方(fang)法：

　　1.SYBRGreenⅠ法：在(zai)PCR反應(ying)體系(xi)中，加(jia)入(ru)過(guo)量SYBR熒光(guang)染料(liao)，SYBR熒光(guang)染料(liao)特(te)異性地摻(chan)入(ru)DNA雙(shuang)鏈(lian)後(hou)，發射熒光(guang)信(xin)號，而(er)不摻(chan)入(ru)鏈(lian)中(zhong)的(de)SYBR染料(liao)分(fen)子不會發射任何(he)熒光(guang)信(xin)號，從而(er)保證(zheng)熒光(guang)信(xin)號的(de)增(zeng)加(jia)與(yu)PCR產物(wu)的(de)增(zeng)加(jia)*同(tong)步。SYBR定量PCR擴增(zeng)熒光(guang)曲(qu)線(xian)圖PCR產物(wu)熔(rong)解曲(qu)線圖(tu)(單(dan)壹峰圖表明(ming)PCR擴增(zeng)產物(wu)的(de)單(dan)壹性)

　　2.TaqMan探(tan)針法：探(tan)針完整時(shi)，報(bao)告(gao)基(ji)團(tuan)發射的(de)熒光(guang)信(xin)號被淬(cui)滅基(ji)團(tuan)吸收;PCR擴增(zeng)時(shi)，Taq酶(mei)的(de)5’-3’外(wai)切酶(mei)活性(xing)將探(tan)針酶(mei)切降解，使(shi)報(bao)告(gao)熒光(guang)基(ji)團(tuan)和(he)淬(cui)滅熒光(guang)基(ji)團(tuan)分(fen)離(li)，從而(er)熒光(guang)監測(ce)系統可接(jie)收(shou)到熒光(guang)信(xin)號，即每(mei)擴(kuo)增(zeng)壹條DNA鏈(lian)，就有(you)壹個(ge)熒光(guang)分(fen)子形(xing)成，實現了(le)熒光(guang)信(xin)號的(de)累(lei)積(ji)與(yu)PCR產物(wu)的(de)形(xing)成*同(tong)步。

　　1. 熒光(guang)閾(yu)值(zhi)(threshold)的(de)設(she)定PCR反應(ying)的(de)前(qian)15個(ge)循(xun)環(huan)的(de)熒光(guang)信(xin)號作(zuo)為(wei)熒光(guang)本底信號，熒光(guang)閾(yu)值(zhi)的(de)缺(que)省(默(mo)認)設置(zhi)是(shi)3-15個(ge)循(xun)環(huan)的(de)熒光(guang)信(xin)號的(de)標(biao)準偏差的(de)10倍(bei)，即：threshold = 10*SDcycle 3-152. Ct值(zhi)與(yu)起(qi)始(shi)模板(ban)的(de)關(guan)系每個(ge)模(mo)板(ban)的(de)Ct值(zhi)與(yu)該模板(ban)的(de)起(qi)始(shi)拷(kao)貝(bei)數的(de)對(dui)數(shu)存(cun)在(zai)線性(xing)關(guan)系，公式(shi)如(ru)下。Ct=-1/lg(1+Ex)*lgX0+lgN/lg(1+Ex)n為(wei)擴增(zeng)反(fan)應(ying)的(de)循(xun)環(huan)次數(shu)，X0為初(chu)始(shi)模板(ban)量，Ex為(wei)擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率(lv)，N為熒光(guang)擴(kuo)增(zeng)信(xin)號達到閾(yu)值(zhi)強(qiang)度(du)時(shi)擴(kuo)增(zeng)產物(wu)的(de)量(liang)。起(qi)始(shi)拷(kao)貝(bei)數越多，Ct值(zhi)越小(xiao)。利(li)用(yong)已(yi)知(zhi)起(qi)始(shi)拷(kao)貝(bei)數的(de)標(biao)準品可作(zuo)出(chu)標準曲線，其中橫(heng)坐(zuo)標代表起(qi)始(shi)拷(kao)貝(bei)數的(de)對(dui)數(shu)，縱坐標(biao)代Ct值(zhi)。因此(ci)，只(zhi)要獲(huo)得(de)未知(zhi)樣(yang)品的(de)Ct值(zhi)，即可(ke)從標準曲線上(shang)計(ji)算(suan)出該樣(yang)品的(de)起(qi)始(shi)拷(kao)貝(bei)數。

　　實時(shi)熒光(guang)定量PCR所(suo)使(shi)用(yong)的(de)熒光(guang)物(wu)質(zhi)可(ke)分(fen)為兩(liang)種(zhong)：

　　1. TaqMan熒光(guang)探(tan)針：PCR擴(kuo)增(zeng)時(shi)在(zai)加入(ru)壹對(dui)引(yin)物(wu)的(de)同(tong)時(shi)加(jia)入(ru)壹個(ge)特(te)異性的(de)熒光(guang)探(tan)針，該探(tan)針為(wei)壹寡核苷酸(suan)，兩(liang)端(duan)分(fen)別標記(ji)壹個(ge)報(bao)告(gao)熒光(guang)基(ji)團(tuan)和(he)壹個(ge)淬(cui)滅熒光(guang)基(ji)團(tuan)。探(tan)針完整時(shi)，報(bao)告(gao)基(ji)團(tuan)發射的(de)熒光(guang)信(xin)號被淬(cui)滅基(ji)團(tuan)吸收;PCR擴增(zeng)時(shi)，Taq酶(mei)的(de)5'-3'外(wai)切酶(mei)活性(xing)將探(tan)針酶(mei)切降解，使(shi)報(bao)告(gao)熒光(guang)基(ji)團(tuan)和(he)淬(cui)滅熒光(guang)基(ji)團(tuan)分(fen)離(li)，從而(er)熒光(guang)監測(ce)系統可接(jie)收(shou)到熒光(guang)信(xin)號，即每(mei)擴(kuo)增(zeng)壹條DNA鏈(lian)，就有(you)壹個(ge)熒光(guang)分(fen)子形(xing)成，實現了(le)熒光(guang)信(xin)號的(de)累(lei)積(ji)與(yu)PCR產物(wu)形(xing)成*同(tong)步。而(er)新(xin)型TaqMan-MGB探(tan)針使(shi)該技(ji)術(shu)既(ji)可(ke)進行(xing)基(ji)因定量分(fen)析(xi)，又(you)可分(fen)析(xi)基(ji)因突(tu)變(bian)(SNP)，有(you)望成為(wei)基(ji)因診斷(duan)和(he)個(ge)體(ti)化用(yong)藥(yao)分(fen)析(xi)的(de)當(dang)選(xuan)技(ji)術(shu)平(ping)臺。

　　2. SYBR熒光(guang)染料(liao)：在(zai)PCR反應(ying)體系(xi)中，加(jia)入(ru)過(guo)量SYBR熒光(guang)染料(liao)，SYBR熒光(guang)染料(liao)非特(te)異性地摻(chan)入(ru)DNA雙(shuang)鏈(lian)後(hou)，發射熒光(guang)信(xin)號，而(er)不摻(chan)入(ru)鏈(lian)中(zhong)的(de)SYBR染料(liao)分(fen)子不會發射任何(he)熒光(guang)信(xin)號，從而(er)保證(zheng)熒光(guang)信(xin)號的(de)增(zeng)加(jia)與(yu)PCR產物(wu)的(de)增(zeng)加(jia)*同(tong)步。SYBR僅與(yu)雙(shuang)鏈(lian)DNA進行(xing)結合，因此(ci)可以通過(guo)溶(rong)解曲(qu)線(xian)，確(que)定PCR反應(ying)是否特(te)異。

　　3. 分(fen)子信(xin)標(biao)：是壹種(zhong)在(zai)5和(he)3末(mo)端(duan)自身(shen)形成壹個(ge)8個(ge)堿(jian)基(ji)左(zuo)右的(de)發夾(jia)結構(gou)的(de)莖(jing)環(huan)雙標(biao)記(ji)寡核苷酸(suan)探(tan)針，兩(liang)端(duan)的(de)核酸(suan)序列互(hu)補(bu)配對(dui)，導(dao)致熒光(guang)基(ji)團(tuan)與(yu)淬(cui)滅基(ji)團(tuan)緊緊靠(kao)近，不會產生熒光(guang)。PCR產物(wu)生(sheng)成後(hou)，退火過(guo)程中(zhong)，分(fen)子信(xin)標(biao)中間(jian)部分(fen)與(yu)特(te)定DNA序列配對(dui)，熒光(guang)基(ji)因與(yu)淬(cui)滅基(ji)因分(fen)離(li)產生熒光(guang) 。

　　1.傳統定量PCR方(fang)法簡介：

　　1)內(nei)參(can)照法：在(zai)不同(tong)的(de)PCR反(fan)應(ying)管中(zhong)加入(ru)已(yi)定量的(de)內(nei)標(biao)和(he)引(yin)物(wu)，內(nei)標(biao)用(yong)基(ji)因工程方(fang)法合成。上(shang)遊引(yin)物(wu)用(yong)熒光(guang)標(biao)記(ji)，下遊引(yin)物(wu)不標記(ji)。在(zai)模板(ban)擴增(zeng)的(de)同(tong)時(shi)，內(nei)標(biao)也(ye)被擴增(zeng)。在(zai)PCR產物(wu)中(zhong)，由(you)於(yu)內(nei)標(biao)與(yu)靶模(mo)板(ban)的(de)長度(du)不同(tong)，二者的(de)擴(kuo)增(zeng)產物(wu)可(ke)用(yong)電(dian)泳或(huo)液相(xiang)分(fen)離(li)開(kai)來(lai)，分(fen)別測定其熒光(guang)強(qiang)度(du)，以內(nei)標(biao)為(wei)對(dui)照定量待檢(jian)測模(mo)板(ban)。

　　2)競爭法：選(xuan)擇由(you)突(tu)變(bian)克(ke)隆產生的(de)含(han)有(you)壹個(ge)新(xin)內(nei)切位(wei)點(dian)的(de)外(wai)源(yuan)競爭性(xing)模板(ban)。在(zai)同(tong)壹反應(ying)管中(zhong)，待測樣(yang)品與(yu)競爭模(mo)板(ban)用同(tong)壹對(dui)引(yin)物(wu)同(tong)時(shi)擴(kuo)增(zeng)(其中壹個(ge)引(yin)物(wu)為(wei)熒光(guang)標(biao)記(ji))。擴(kuo)增(zeng)後(hou)用內(nei)切酶(mei)消化PCR產物(wu)，競爭性(xing)模板(ban)的(de)產物(wu)被酶(mei)解為(wei)兩(liang)個(ge)片(pian)段(duan)，而(er)待(dai)測模板(ban)不被酶(mei)切，可(ke)通過(guo)電泳或(huo)液相(xiang)將兩(liang)種(zhong)產物(wu)分(fen)開(kai)，分(fen)別測定熒光(guang)強(qiang)度(du)，根(gen)據(ju)已知(zhi)模(mo)板(ban)推(tui)測(ce)未(wei)知(zhi)模板(ban)的(de)起(qi)始(shi)拷(kao)貝(bei)數。3)PCR-ELISA法：利(li)用(yong)digaoxin或(huo)生物(wu)素(su)等(deng)標記(ji)引(yin)物(wu)，擴(kuo)增(zeng)產物(wu)被固(gu)相(xiang)板(ban)上(shang)特(te)異的(de)探(tan)針所(suo)結合，再加(jia)入(ru)抗(kang)digaoxin或(huo)生物(wu)素(su)酶(mei)標抗(kang)體(ti)-辣(la)根(gen)過(guo)氧化物(wu)酶(mei)結合物(wu)，終(zhong)酶(mei)使(shi)底物(wu)顯(xian)色。常規的(de)PCR-ELISA法只(zhi)是(shi)定性實驗，若(ruo)加(jia)入(ru)內(nei)標(biao)，作(zuo)出(chu)標準曲線，也可(ke)實現定量檢(jian)測目(mu)的(de)。

　　2.內(nei)標(biao)在(zai)傳統定量中的(de)作(zuo)用(yong)由於(yu)傳統定量方(fang)法都是(shi)終(zhong)點(dian)檢(jian)測，即PCR到達平(ping)臺期(qi)後(hou)進行(xing)檢(jian)測，而(er)PCR經(jing)過(guo)對(dui)數(shu)期(qi)擴增(zeng)到達平(ping)臺期(qi)時(shi)，檢(jian)測重現性(xing)極(ji)差。同(tong)壹個(ge)模(mo)板(ban)在(zai)96孔(kong)PCR儀上(shang)做(zuo)96次重復實驗，所(suo)得結果有(you)很(hen)大(da)差(cha)異(yi)，因此(ci)無法直接(jie)從終點(dian)產物(wu)量(liang)推(tui)算(suan)出起(qi)始(shi)模板(ban)量。加(jia)入(ru)內(nei)標(biao)後(hou)，可部分(fen)消除終產物(wu)定量所(suo)造(zao)成的(de)不準確性。但即使(shi)如(ru)此(ci)，傳統的(de)定量方(fang)法也都(dou)只(zhi)能(neng)算(suan)作(zuo)半(ban)定量、粗(cu)略(lve)定量的(de)方(fang)法。

　　3.內(nei)標(biao)對(dui)定量PCR的(de)影(ying)響若(ruo)在(zai)待測(ce)樣(yang)品中(zhong)加(jia)入(ru)已(yi)知(zhi)起(qi)始(shi)拷(kao)貝(bei)數的(de)內(nei)標(biao)，則(ze)PCR反應(ying)變為(wei)雙重PCR，雙(shuang)重PCR反(fan)應(ying)中存(cun)在(zai)兩(liang)種(zhong)模板(ban)之間(jian)的(de)幹(gan)擾和(he)競爭，尤(you)其當(dang)兩(liang)種(zhong)模板(ban)的(de)起(qi)始(shi)拷(kao)貝(bei)數相(xiang)差比(bi)較(jiao)大(da)時(shi)，這(zhe)種(zhong)競爭會表現得(de)更(geng)為顯著(zhu)。但(dan)由於(yu)待測(ce)樣(yang)品的(de)起(qi)始(shi)拷(kao)貝(bei)數是(shi)未(wei)知(zhi)的(de)，所(suo)以無法加入(ru)合適(shi)數量的(de)已(yi)知(zhi)模板(ban)作(zuo)為(wei)內(nei)標(biao)。也(ye)正是這個(ge)原(yuan)因，傳統定量方(fang)法雖然(ran)加入(ru)內(nei)標(biao)，但(dan)仍然(ran)只(zhi)是(shi)壹種(zhong)半定量的(de)方(fang)法。 實時(shi)熒光(guang)定量PCR技(ji)術(shu)有(you)效(xiao)地解(jie)決(jue)了傳統定量只(zhi)能(neng)終(zhong)點(dian)檢(jian)測的(de)局限，實現了(le)每(mei)壹輪循(xun)環(huan)均(jun)檢(jian)測壹次熒光(guang)信(xin)號的(de)強(qiang)度(du)，並(bing)記(ji)錄(lu)在(zai)電腦(nao)軟件(jian)之中，通過(guo)對(dui)每(mei)個(ge)樣(yang)品Ct值(zhi)的(de)計(ji)算(suan)，根(gen)據(ju)標準曲線獲(huo)得(de)定量結果。

　　因此(ci)，實時(shi)熒光(guang)定量PCR無需(xu)內(nei)標(biao)是(shi)建(jian)立(li)在(zai)兩(liang)個(ge)基(ji)礎(chu)之(zhi)上(shang)的(de)：

　　1)Ct值(zhi)的(de)重現性(xing)PCR循(xun)環(huan)在(zai)到達Ct值(zhi)所(suo)在(zai)的(de)循(xun)環(huan)數時(shi)，剛(gang)剛(gang)進入(ru)真正的(de)指(zhi)數(shu)擴(kuo)增(zeng)期(qi)(對(dui)數(shu)期(qi))，此(ci)時(shi)微(wei)小(xiao)誤(wu)差(cha)尚未放大(da)，因此(ci)Ct值(zhi)的(de)重現性(xing)*，即同(tong)壹模板(ban)不同(tong)時(shi)間(jian)擴(kuo)增(zeng)或(huo)同(tong)壹時(shi)間(jian)不同(tong)管內(nei)擴(kuo)增(zeng)，得(de)到的(de)Ct值(zhi)是(shi)恒(heng)定的(de)。

　　2)Ct值(zhi)與(yu)起(qi)始(shi)模板(ban)的(de)線(xian)性(xing)關(guan)系由於(yu)Ct值(zhi)與(yu)起(qi)始(shi)模板(ban)的(de)對(dui)數(shu)存(cun)在(zai)線性(xing)關(guan)系，可利(li)用(yong)標(biao)準曲線對(dui)未(wei)知(zhi)樣(yang)品進行(xing)定量測定，因此(ci)，實時(shi)熒光(guang)定量PCR是壹種(zhong)采用外標(biao)準曲線定量的(de)方(fang)法。外標(biao)準曲線的(de)定量方(fang)法相(xiang)比(bi)內(nei)標(biao)法是壹種(zhong)準確的(de)、值(zhi)得(de)信賴(lai)的(de)科(ke)學(xue)方(fang)法。利(li)用(yong)外(wai)標(biao)準曲線的(de)實時(shi)熒光(guang)定量PCR是迄今為(wei)止定量準確，重現性(xing)的(de)定量方(fang)法，已得(de)到*的(de)*，廣(guang)泛(fan)用於基(ji)因表達研究、轉基(ji)因研究(jiu)，藥(yao)物(wu)療效(xiao)考核、病原(yuan)體(ti)檢(jian)測等(deng)諸多(duo)領(ling)域(yu)。 各(ge)級各(ge)類(lei)醫(yi)療機構(gou)、大(da)學(xue)及(ji)研究所(suo)、CDC、檢(jian)驗檢(jian)疫局、獸醫(yi)站、食品(pin)企業(ye)及(ji)乳(ru)品廠(chang)等(deng)。由於(yu)qPCR是實時(shi)定量檢(jian)測致病(bing)病原(yuan)體基(ji)因核酸(suan)，因此(ci)它比(bi)化學(xue)發光(guang)、時(shi)間(jian)分(fen)辨、蛋(dan)白芯(xin)片(pian)等(deng)免疫學(xue)方(fang)法更(geng)具(ju)獨(du)到優
 

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