實(shi)驗方法原(yuan)理(li):

　　實(shi)時熒(ying)光定(ding)量(liang)PCR技(ji)術(shu)，是(shi)指(zhi)在PCR反應(ying)體(ti)系中加入(ru)熒(ying)光(guang)基(ji)團(tuan)，利用(yong)熒光(guang)信號(hao)積(ji)累實(shi)時監(jian)測整個(ge)PCR進(jin)程(cheng)，後通過標(biao)準(zhun)曲線對(dui)未(wei)知模板(ban)進(jin)行定(ding)量(liang)分析(xi)的(de)方(fang)法(fa)。

　　儀器(qi)、耗(hao)材(cai):

　　離心(xin)管(guan)

　　離(li)心(xin)機(ji)

　　風(feng)光(guang)光度計

　　電泳槽(cao)

　　凝膠板(ban)

　　Realtime PCR儀

　　實(shi)驗步驟:

　　壹(yi)、 樣品(pin)RNA的抽提

　　1. 取(qu)凍(dong)存(cun)已(yi)裂解(jie)的(de)細(xi)胞(bao)，室溫(wen)放置(zhi)5分鐘(zhong)使其(qi)*溶(rong)解(jie)。

　　二、 RNA質(zhi)量(liang)檢(jian)測

　　1. 紫(zi)外吸收法測定(ding)

　　先用(yong)稀(xi)釋用的TE溶(rong)液(ye)將(jiang)分光光(guang)度計調零。然後取(qu)少量(liang)RNA溶(rong)液(ye)用(yong)TE稀(xi)釋(1:100)後，讀取(qu)其在分光光(guang)度計260nm和280nm處(chu)的(de)吸收值(zhi)，測(ce)定(ding)RNA溶(rong)液(ye) 濃(nong)度(du)和純度。

　　(1)濃(nong)度(du)測定(ding)

　　A260下(xia)讀(du)值(zhi)為(wei)1表(biao)示(shi)40 ug RNA/ml。樣(yang)品(pin)RNA濃(nong)度(du)(μg/ml)計算(suan)公(gong)式為：A260 x 稀(xi)釋倍數(shu) x 40 ug/ml。具體(ti)計算(suan)如(ru)下：

　　RNA溶(rong)於40 ul DEPC水中，取(qu)5 ul，1:100稀(xi)釋至495 ul的TE中，測得(de)A260 = 0.21

　　RNA 濃(nong)度(du)= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或(huo) 0.84 ug/ul

　　取(qu)5 ul用來測(ce)量(liang)以(yi)後，剩余樣品(pin)RNA為35 ul，剩余RNA總量(liang)為(wei)：

　　35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

　　(2)純度檢(jian)測

　　RNA溶(rong)液(ye)的(de)A260/A280的比(bi)值(zhi)即(ji)為(wei)RNA純度，比(bi)值(zhi)範(fan)圍1.8到(dao)2.1。

　　2. 變性(xing)瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝膠電泳測(ce)定(ding)

　　(1)制(zhi)膠

　　三、樣(yang)品(pin)cDNA合(he)成

　　四(si)、 梯(ti)度稀(xi)釋的標(biao)準(zhun)品(pin)及待測(ce)樣(yang)品(pin)的管(guan)家基(ji)因(yin)(β-actin)實(shi)時定(ding)量(liang)PCR

　　五(wu)、 制(zhi)備用於繪制(zhi)梯(ti)度稀(xi)釋標(biao)準(zhun)曲線的(de)DNA模板(ban)

　　六(liu)、 待測(ce)樣(yang)品(pin)的待測(ce)基(ji)因(yin)實(shi)時定(ding)量(liang)PCR

　　1. 所有(you)cDNA樣品(pin)分別配置(zhi)實(shi)時定(ding)量(liang) PCR反應(ying)體(ti)系。

　　2. 體(ti)系配置(zhi)如(ru)下：

　　序(xu)號 反應(ying)物(wu) 劑(ji)量(liang)

　　1 SYBR Green 1 染(ran)料 10 ul

　　2 上遊引(yin)物(wu) 1 ul

　　3 下遊(you)引(yin)物(wu) 1 ul

　　4 dNTP 1 ul

　　5 Taq聚(ju)合(he)酶 2 ul

　　6 待測(ce)樣(yang)品(pin)cDNA 5 ul

　　7 ddH2O 30 ul

　　8 總體(ti)積(ji) 50 ul

　　輕(qing)彈(dan)管底(di)將(jiang)溶(rong)液(ye)混(hun)合(he)，6 000 rpm短(duan)暫離(li)心(xin)。

　　(3)將(jiang)配(pei)制(zhi)好(hao)的PCR反應(ying)溶(rong)液(ye)置(zhi)於Realtime PCR儀上(shang)進(jin)行PCR擴增反應(ying)。反應(ying)條件(jian)為(wei)：93℃ 2分鐘(zhong)預變(bian)性(xing)，然(ran)後按(an)93℃ 1分鐘(zhong)，55℃1分鐘(zhong)，72℃1分鐘(zhong)，共40做(zuo)個(ge)循環，後72℃7分鐘(zhong)延伸。

　　七(qi)、 實(shi)時定(ding)量(liang)PCR使(shi)用引(yin)物(wu)列(lie)表(biao)

　　引(yin)物(wu)設計軟件(jian)：Primer Premier 5.0，並遵循以(yi)下原(yuan)則(ze)：引(yin)物(wu)與(yu)模板(ban)的序(xu)列(lie)緊(jin)密(mi)互補;引(yin)物(wu)與(yu)引(yin)物(wu)之(zhi)間(jian)避(bi)免(mian)形成(cheng)穩(wen)定(ding)的(de)二聚(ju)體(ti)或(huo)發(fa)夾(jia)結(jie)構;引(yin)物(wu)不(bu)在模板(ban)的非目(mu)的(de)位點引(yin)發(fa)DNA 聚(ju)合(he)反應(ying)(即(ji)錯配(pei))。

　　八(ba)、電泳

       各(ge)樣(yang)品(pin)的目(mu)的基(ji)因(yin)和管(guan)家(jia)基(ji)因(yin)分別進(jin)行Realtime PCR反應(ying)。PCR產(chan)物與(yu) DNA Ladder在2％瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝膠電泳，GoldView染(ran)色，檢測PCR產(chan)物是(shi)否為單(dan)壹(yi)特異(yi)性擴增條帶。