推薦(jian)關(guan)鍵詞：熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR耗(hao)材(cai)，實(shi)驗(yan)室耗(hao)材(cai)，PCR管(guan)，PCR板(ban)，本生(sheng)生(sheng)物PCR耗(hao)材(cai)

　　熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR實(shi)驗(yan)步(bu)驟(zhou)：

　　①取(qu)凍(dong)存已(yi)裂(lie)解的細胞，室溫(wen)放置5分鐘使其*溶(rong)解(jie)。

　　②兩(liang)相(xiang)分離 每(mei)1ml的TRIZOL試(shi)劑(ji)裂(lie)解的樣品中加入(ru)0.2ml的lvfang，蓋(gai)緊(jin)管(guan)蓋(gai)。手(shou)動(dong)劇烈(lie)振蕩(dang)管(guan)體15秒(miao)後，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下(xia)12000rpm離心(xin)15分鐘。離心(xin)後混(hun)合(he)液(ye)體將(jiang)分為下(xia)層(ceng)的紅色(se)酚(fen)lvfang相(xiang)，中間(jian)層(ceng)以及無色(se)水(shui)相(xiang)上層(ceng)。RNA全部被分配於水相(xiang)中。水(shui)相(xiang)上層(ceng)的體積大(da)約(yue)是(shi)勻(yun)漿時加入(ru)的TRIZOL試(shi)劑(ji)的60%。

　　③RNA沈澱(dian) 將(jiang)水(shui)相(xiang)上層(ceng)轉(zhuan)移(yi)到壹(yi)幹(gan)凈(jing)無RNA酶的離心(xin)管中。加等體積異(yi)丙醇(chun)混合(he)以沈澱(dian)其(qi)中的RNA，混勻(yun)後15到30℃孵育10分鐘後，於(yu)4℃下(xia)12000rpm 離心(xin)10分鐘。此時離(li)心(xin)前(qian)不可見(jian)的RNA沈澱(dian)將(jiang)在管底(di)部和側壁(bi)上形(xing)成膠狀(zhuang)沈澱塊(kuai)。

　　④RNA清(qing)洗(xi) 移(yi)去上清液(ye)，每(mei)1mlTRIZOL試(shi)劑(ji)裂(lie)解的樣品中加入(ru)至少1ml的75%乙醇(chun)(75%乙醇(chun)用DEPCH2O配(pei)制(zhi))，清洗(xi)RNA沈(chen)澱。混勻(yun)後，4℃下(xia)7000rpm離心(xin)5分鐘。

　　⑤RNA幹燥(zao) 小(xiao)心(xin)吸去大(da)部分乙醇(chun)溶(rong)液(ye)，使RNA沈澱(dian)在室溫(wen)空氣(qi)中幹(gan)燥(zao)5-10分鐘。

　　⑥溶(rong)解(jie)RNA沈(chen)澱(dian) 溶(rong)解(jie)RNA時，先(xian)加入(ru)無RNA酶的水40μl用槍反(fan)復(fu)吹(chui)打幾次(ci)，使其*溶(rong)解(jie)，獲(huo)得(de)的RNA溶(rong)液(ye)保存於(yu)-80℃待(dai)用。 1)紫(zi)外(wai)吸收法(fa)測定

　　先用稀(xi)釋(shi)用的TE溶(rong)液(ye)將(jiang)分光光度計(ji)調零。然(ran)後取(qu)少量RNA溶(rong)液(ye)用TE稀(xi)釋(shi)(1:100)後，讀(du)取(qu)其在分光光度計(ji)260nm和280nm處(chu)的吸收值(zhi)，測定RNA溶(rong)液(ye) 濃度和純(chun)度。

　　① 濃(nong)度測定

　　A260下(xia)讀值(zhi)為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(ji)算公式(shi)為：A260 ×稀釋(shi)倍數(shu)× 40 μg/ml。具體計(ji)算如(ru)下(xia)：

　　RNA溶(rong)於(yu)40 μl DEPC水(shui)中(zhong)，取(qu)5ul，1:100稀釋(shi)至495μl的TE中，測得(de)A260 = 0.21

　　RNA 濃(nong)度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或(huo) 0.84 μg/μl

　　取(qu)5ul用來(lai)測量以後，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總(zong)量為：

　　35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

　　②純度檢(jian)測

　　RNA溶(rong)液(ye)的A260/A280的比值(zhi)即為RNA純度，比(bi)值(zhi)範(fan)圍(wei)1.8到2.1。

　　2)變性瓊脂糖凝膠電(dian)泳測定

　　①制膠

　　1g瓊(qiong)脂糖溶(rong)於(yu)72ml水(shui)中(zhong)，冷(leng)卻(que)至(zhi)60℃，10 ml的10× MOPS電泳(yong)緩沖(chong)液(ye)和18 ml的37% 甲(jia)醛(quan)溶(rong)液(ye)(12.3 M)。

　　灌制凝膠板(ban)，預留加樣孔至少可以加入(ru)25 μl溶(rong)液(ye)。膠凝後取(qu)下(xia)梳(shu)子(zi)，將(jiang)凝膠板(ban)放入(ru)電泳(yong)槽內(nei)，加足(zu)量的1×MOPS電泳(yong)緩沖(chong)液(ye)至覆(fu)蓋(gai)膠(jiao)面(mian)幾個(ge)毫米。

　　②準(zhun)備(bei)RNA樣品

　　取3μgRNA，加3倍體積的甲(jia)醛(quan)上樣染液(ye)，加EB於(yu)甲(jia)醛(quan)上樣染液(ye)中至(zhi)終(zhong)濃(nong)度為10μg/ml。加熱(re)至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

　　③電泳

　　上樣前(qian)凝膠須(xu)預電(dian)泳5min，隨後將(jiang)樣品加入(ru)上樣孔。5–6V/cm電壓下(xia)2h，電泳(yong)至溴酚(fen)蘭指(zhi)示(shi)劑進(jin)膠(jiao)至(zhi)少2–3cm。

　　④紫外透(tou)射光下(xia)觀察(cha)並拍(pai)照

　　28S和18S核(he)糖體RNA的帶非(fei)常亮而(er)濃(其(qi)大(da)小(xiao)決定(ding)於(yu)用於(yu)抽(chou)提(ti)RNA的物種(zhong)類(lei)型(xing))，上面壹條帶(dai)的密度大(da)約(yue)是(shi)下(xia)面壹(yi)條帶的2倍。還(hai)有(you)可能(neng)觀察(cha)到壹(yi)個(ge)更(geng)小(xiao)稍微(wei)擴散(san)的帶，它(ta)由低分子量的RNA(tRNA和5S核(he)糖體RNA)組成。在18S和28S核(he)糖體帶之(zhi)間(jian)可以看(kan)到壹(yi)片(pian)彌散(san)的EB染色(se)物質(zhi)，可能(neng)是(shi)由mRNA和其(qi)它異(yi)型(xing)RNA組(zu)成。RNA制備(bei)過(guo)程中如(ru)果出(chu)現DNA汙(wu)染，將(jiang)會在28S核(he)糖體RNA帶的上面出(chu)現，即(ji)更(geng)高(gao)分子量的彌散(san)遷移(yi)物質(zhi)或(huo)者帶，RNA的降解表現為核(he)糖體RNA帶的彌散(san)。用數(shu)碼(ma)照(zhao)相(xiang)機拍(pai)下(xia)電泳(yong)結果。 ①反(fan)應體系(xi) 序(xu)號 反(fan)應物 劑(ji)量 1 逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)buffer 2μl 2 上遊引(yin)物 0.2μl 3 下(xia)遊引(yin)物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)MMLV 0.5μl 6 DEPC水(shui) 5μl 7 RNA模(mo)版 2μl 8 總(zong)體積 10μl 輕彈(dan)管底將(jiang)溶(rong)液(ye)混合(he)，6000rpm短暫(zan)離(li)心(xin)。

　　②混合液(ye)在加入(ru)逆轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)MMLV 之(zhi)前(qian)先70℃幹(gan)浴3分鐘，取出(chu)後立(li)即(ji)冰(bing)水(shui)浴至管內外溫度壹(yi)致，然後加逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)0.5μl，37℃水(shui)浴60分鐘。

　　③取出(chu)後立(li)即(ji)95℃幹浴3分鐘，得(de)到逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)終(zhong)溶(rong)液(ye)即為cDNA溶(rong)液(ye)，保存於(yu)-80℃待(dai)用。 管(guan)家(jia)基(ji)因(β-actin)實(shi)時定(ding)量PCR

　　①β-actin陽性(xing)模(mo)板(ban)的標準(zhun)梯(ti)度制(zhi)備(bei) 陽性(xing)模(mo)板(ban)的濃度為1011，反(fan)應前(qian)取3μl按10倍稀(xi)釋(shi)(加水(shui)27μl並充分混勻(yun))為1010，依(yi)次(ci)稀釋(shi)至109、108、107、106、105、104，以備(bei)用。

　　②反(fan)應體系(xi)如(ru)下(xia)：

　　標準(zhun)品反(fan)應體系(xi) 序(xu)號 反(fan)應物 劑(ji)量 1 SYBR Green 1 染料(liao) 10μl 2 陽性(xing)模(mo)板(ban)上遊引(yin)物F 0.5μl 3 陽性(xing)模(mo)板(ban)下(xia)遊引(yin)物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶(mei) 1μl 6 陽性(xing)模(mo)板(ban)DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈(dan)管底將(jiang)溶(rong)液(ye)混合(he)，6000rpm短暫(zan)離(li)心(xin)。

　　管家(jia)基(ji)因反(fan)應體系(xi)： 序(xu)號 反(fan)應物 劑(ji)量 1 SYBR Green 1 染料(liao) 10μl 2 內參照(zhao)上遊引(yin)物F 0.5μl 3 內(nei)參照(zhao)下(xia)遊引(yin)物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶(mei) 1μl 6 待(dai)測樣品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈(dan)管底將(jiang)溶(rong)液(ye)混合(he)，6000rpm短暫(zan)離(li)心(xin)。

　　③制備(bei)好(hao)的陽性(xing)標(biao)準(zhun)品和檢(jian)測樣本(ben)同(tong)時上機，反(fan)應條(tiao)件為：93℃2分鐘，然後93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(ge)循環。 ①針(zhen)對(dui)每(mei)壹需要(yao)測量的基(ji)因，選(xuan)擇(ze)壹(yi)確(que)定(ding)表達該基(ji)因的cDNA模(mo)板(ban)進(jin)行PCR反(fan)應。

　　反(fan)應體系(xi)： 序(xu)號 反(fan)應物 劑(ji)量 1 10×PCR緩沖(chong)液(ye) 2.5 ul 2 MgCl2溶(rong)液(ye) 1.5 ul 3 上遊引(yin)物F 0.5 ul 4 下(xia)遊引(yin)物R 0.5 ul 5 dNTP混(hun)合(he)液(ye) 3 ul 6 Taq聚(ju)合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水(shui)至總(zong)體積為 25ul 輕彈(dan)管底將(jiang)溶(rong)液(ye)混合(he)，6000rpm短暫(zan)離(li)心(xin)。

　　35個(ge)PCR循環(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72℃延伸5分鐘。

　　②PCR產物與(yu) DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電(dian)泳，溴化乙錠(ding)染色(se)，檢(jian)測PCR產物是(shi)否(fou)為單(dan)壹(yi)特(te)異(yi)性擴增條帶(dai)。

　　③將(jiang)PCR產物進(jin)行10倍梯(ti)度稀(xi)釋(shi): 設(she)定(ding)PCR產物濃(nong)度為1×1010，依(yi)次(ci)稀釋(shi)至109、108、107、106、105、104幾個(ge)濃度梯(ti)度。 ①所(suo)有(you)cDNA樣品分別配置實(shi)時定(ding)量 PCR反(fan)應體系(xi)。

　　體系(xi)配置如(ru)下(xia)： 序(xu)號 反(fan)應物 劑(ji)量 1 SYBR Green 1 染料(liao) 10 ul 2 上遊引(yin)物 1ul 3 下(xia)遊引(yin)物 1ul 4 dNTP 1ul 5 Taq聚(ju)合酶 2ul 6 待測樣品cDNA 5ul 7 ddH2O 30ul 8 總體積 50 ul 輕彈(dan)管底將(jiang)溶(rong)液(ye)混合(he)，6000rpm短暫(zan)離(li)心(xin)。

　　②將(jiang)配(pei)制(zhi)好(hao)的PCR反(fan)應溶(rong)液(ye)置於(yu)Realtime PCR儀(yi)上進(jin)行PCR擴(kuo)增反(fan)應。反(fan)應條(tiao)件為：93℃2分鐘預變性，然後按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做(zuo)個(ge)循環，後72℃7分鐘延伸。 各(ge)樣品的目的基(ji)因和管(guan)家(jia)基(ji)因分別進(jin)行Realtime PCR反(fan)應。PCR產物與(yu) DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電(dian)泳，GoldView染色(se)，檢(jian)測PCR產物是(shi)否(fou)為單(dan)壹(yi)特(te)異(yi)性擴增條帶(dai)。

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