細胞培養(yang)—如(ru)何揭(jie)開(kai)細胞凍(dong)存(cun)與復蘇的(de)秘(mi)密(mi)！

在美(mei)國科(ke)幻大(da)片中(zhong)，經常(chang)會(hui)有(you)因(yin)為(wei)某些特殊原(yuan)因(yin)被凍(dong)存(cun)起來(lai)的(de)超(chao)人(ren)，醒來(lai)已經(jing)過了(le)百年(nian)，容(rong)顏(yan)依舊、身(shen)體(ti)機(ji)能(neng)依舊(jiu)，依然可(ke)以拯(zheng)救人(ren)類(lei)。這其(qi)中(zhong)就(jiu)涉(she)及(ji)到壹個(ge)細胞凍(dong)存(cun)的(de)概(gai)念，細胞凍(dong)存(cun)是(shi)將(jiang)細胞放(fang)在低溫環境(jing)，減(jian)少(shao)細胞代(dai)謝(xie)，以便(bian)長(chang)期(qi)儲(chu)存(cun)的(de)壹(yi)種技術。細胞凍(dong)存(cun)是(shi)細胞保(bao)存(cun)的(de)主要(yao)方(fang)法之壹(yi)，起到了(le)細胞保(bao)種(zhong)的(de)作(zuo)用。其(qi)實自(zi)己也(ye)可(ke)以動手(shou)來(lai)做關(guan)於細胞凍(dong)存(cun)的(de)實(shi)驗，下面(mian)本(ben)生(sheng)科(ke)技就(jiu)具(ju)體(ti)來(lai)分析下吧(ba)!

細胞凍(dong)存(cun)操作(zuo)步驟(zhou)：

1.用(yong)移(yi)液器吸走原(yuan)培養(yang)基，加(jia)入適(shi)量(liang)PBS洗1-2遍(bian);

2.加入適(shi)量(liang)胰酶(mei)，置於培養(yang)箱中(zhong)消(xiao)化;

3.待消(xiao)化到位後(hou)加(jia)入適(shi)量(liang)血清(qing)或(huo)*培養(yang)基終止(zhi)消(xiao)化，800-1000rpm離心(xin)3-5min;

4.配(pei)制凍存液(ye)，待(dai)細胞離心(xin)後(hou)去(qu)上(shang)清(qing)，加(jia)入凍(dong)存液(ye)重懸(xuan)，調整(zheng)細胞濃(nong)度(du)為(wei)3×106~1×107 cells/mL，轉(zhuan)移(yi)到凍存(cun)管中(zhong);

5.將(jiang)凍存(cun)管放(fang)入程(cheng)序降(jiang)溫(wen)盒(he)中(zhong)，-80度(du)過夜，然(ran)後(hou)轉(zhuan)移(yi)到液氮(dan)中(zhong)保存(cun)。

6.凍(dong)存細胞後(hou)應(ying)取出壹管復(fu)蘇，檢(jian)測(ce)細胞的(de)存(cun)活(huo)率。理論(lun)上細胞可(ke)在液氮(dan)內長期(qi)保(bao)存(cun)，為(wei)穩(wen)妥(tuo)起見可(ke)在細胞凍(dong)存(cun)半(ban)年(nian)後(hou)復(fu)蘇培養(yang)，觀察(cha)細胞生(sheng)長(chang)情況，再繼續凍(dong)存。

細胞凍(dong)存(cun)註(zhu)意事項：

1.凍(dong)存液(ye)常(chang)規(gui)配(pei)比為(wei)培養(yang)基：血清(qing)：DMSO=7:2:1，如(ru)果(guo)細胞比較(jiao)珍(zhen)貴，可(ke)以調整(zheng)為(wei)血清(qing)：DMSO=9:1;

2.如(ru)果(guo)沒(mei)有(you)程序降(jiang)溫(wen)盒(he)，可(ke)以將(jiang)凍存(cun)細胞依(yi)次(ci)放(fang)於4度(du)1h，-20度(du)2h，-80過夜，再轉(zhuan)至液(ye)氮罐內;

3.凍存細胞儲(chu)存(cun)在-80度(du)中(zhong)通(tong)常不(bu)建議(yi)超過(guo)半(ban)年(nian)，液氮中(zhong)通(tong)常不(bu)建議(yi)超過(guo)2年(nian);

4.細胞如(ru)果(guo)是(shi)次(ci)養(yang)，建議至少(shao)凍(dong)存兩(liang)個(ge)批次(ci)以上，以盡量(liang)避免(mian)因(yin)為(wei)凍(dong)存(cun)問(wen)題(ti)導(dao)致(zhi)細胞絕(jue)種;

細胞復(fu)蘇操作(zuo)步驟(zhou)：

1.準備(bei)工作：開(kai)啟(qi)恒溫(wen)水浴鍋，將(jiang)溫度(du)調節在37℃，取壹(yi)離心(xin)管，加(jia)入5ml細胞培養(yang)基;

2.取(qu)出凍(dong)存管，立(li)即放(fang)入水(shui)浴鍋(guo)中(zhong)快速(su)搖晃(huang)，讓(rang)凍存液(ye)迅(xun)速融化;

3.打開(kai)凍存(cun)管，將(jiang)凍存(cun)液小(xiao)心(xin)轉(zhuan)移(yi)到預(yu)先(xian)加(jia)入有(you)培養(yang)基的(de)離心(xin)管中(zhong)，800rpm離心(xin)5分鐘(zhong);

4.小(xiao)心(xin)棄(qi)掉(diao)上清(qing)，加(jia)入約5ml培養(yang)基重懸(xuan)細胞;

5.將(jiang)所得細胞懸(xuan)液(ye)轉(zhuan)移(yi)入培養(yang)瓶中(zhong)，蓋上(shang)瓶(ping)塞(sai)，置培養(yang)箱培養(yang)，觀察(cha)細胞的(de)狀(zhuang)態(tai);